DNA的二級結構是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結構。兩條多核苷酸鏈以相同的旋轉繞同一個公共軸形成右手雙螺旋，螺旋的直徑2.0nm；兩條多核苷酸鏈是反向平行的，一條5’-3方向，另一條3’-5’方向；兩條多核苷酸鏈的糖-磷酸骨架位于雙螺旋外側，堿基平面位于鏈的內側；相鄰堿基對之間的軸向距離為0.34nm，每個螺旋的軸距為3.4nm。
DNA二級結構的穩定作用力有兩條多核苷酸鏈間的互補堿基對之間的氫鍵；堿基對疏水的芳香環堆積所產生的疏水作用力，以及堆積的堿基對間的范德華力；磷酸基團上的負電荷與介質中的陽離子化合物之間形成的鹽鍵。