DNA實驗技術：原位雜交實驗要求及步驟1

原位雜交組織（或細胞）化學 （In situ Hybridization Histochemistry，ISHH） 簡稱原位雜交（In Situ Hybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。根據所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。

根據探針的標記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進行雜交，雜交后分別通過放射自顯影、熒光顯微鏡術或成色酶促反應直接顯示。間接法一般用半抗原標記探針，zui后通過免疫組織化學法對半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。

原位雜交zui初是以同位素標記探針進行的。盡管同位素標記（如³⁵S，³H，³²P等）仍然廣泛使用，但非同位素標記探針的迅速發展（尤其是生物素標記探針和地高辛標記探針），更引起科技工作者的極大興趣。

一、基本要求

1.  組織取材：組織取材應盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養細胞zui好在30 min 內固定。

2.  固定目的是：

（1）保持細胞結構；

（2）zui大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；

（3）使探針易于進入細胞或組織。

zui常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。

3.  增強組織的通透性和核酸探針的穿透性：

（1）稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結合，以降低背景，雜交前標本可用0.25%乙酸酐處理10 min，經乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團通過乙酰化而被阻斷。組織和細胞標本亦可用0.2 M HCl處理10 min，稀酸能使堿性蛋白變性，結合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。

（2）去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進入組織細胞，zui常應用的去污劑是Triton X-100。注意：過度的去污劑處理不僅影響組織的形態結構，而且還會引起靶核酸的丟失。

（3） 蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），還有鏈霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。

4.  雜交緩沖液孵育：

雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2 hr，以阻斷玻片和標本中可能與探針產生非特異性結合的位點，達到減低背景的目的。

5.  防止污染：

由于在手指皮膚及實驗室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結果，在整個雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實驗所用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤（180℃）以達到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時所用的溶液均需經高壓消毒處理。

6.  雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：

雜交反應進行時，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進行雜交（包括檢測RNA時），雙鏈DNA探針在雜交前必須進行變性。探針變性后要立即進行雜交反應，不然解鏈的探針又會重新復性。

雜交液： 
雜交液內除含一定濃度的標記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。

雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標本之間的靜電結合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。

所以，雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態結構的破壞以及標本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達到提高雜交率的目的（尤其對雙鏈核酸探針）。

在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結構成分之間的非特異性結合，以減低背景。

探針的濃度： 
探針濃度依其種類和實驗要求略有不同，一般為0.5~5.0 μg/ml（0.5~5.0 ng/μl）。zui適宜的探針濃度要通過實驗才能確定。

探針的長度： 
一般應在50-300個堿基之間，zui長不宜超過400個堿基。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。

二、試劑準備 
1.   0.1 M PBS （pH7.2）：Na₂HPO₄?12 H₂O 61.6 g、NaH₂PO₄?2 H₂O 5.6 g、NaCl 9 g，加ddH₂O至2000 ml，高壓滅菌。
2.  0.2 M PB （（pH7.2）：Na₂HPO₄?12 H₂O 61.6 g、NaH₂PO₄?2 H₂O 5.6 g 加ddH₂O至1000 ml，高壓滅菌。
3.  0.1 M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1 M PBS，定容至100 ml，高壓滅菌。
4.  4%多聚甲醛：多聚甲醛40 g加ddH₂O 400 ml，加熱至70℃左右，用1 M NaOH調pH至7.0，用ddH₂O定容至500 ml，再加0.2 M PBS 500 ml，總體積為1000 ml。
5.  16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4 g、小牛血清白蛋白（BSA） 0.4 g、聚蔗糖0.4 g，加dd H₂O至10 ml，無菌抽濾、分裝， -20℃保存備用。
6.  預雜交液：去離子甲酰胺10 ml、50%硫酸葡聚糖4 ml，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2 ml、1 M Tris-HCl（pH 8.0） 0.2 ml、5 M NaCl 1.2 ml、0.5 M EDTA（pH 8.0） 0.04 ml、0.1 M 二硫蘇糖醇 2 ml、ddH₂O 2.21 ml，總體積為10 ml。無菌抽濾、分裝，-20℃保存備用。臨用前加入50 mg/ml 變性鮭魚精DNA 75 μl/ml。
7.  20×SSC: NaCl 175.3 g、檸檬酸三鈉88.2 g，加水至800 ml，用2 N NaOH調pH至7.0，再用ddH₂O定容至1000 ml。
8.  抗體稀釋液：Triton X-100 80 μl、BSA 0.2 g，以0.05 M PBS定容至20 ml。
9.  TSM1：1 M Tris-HCl（pH 8.0）10 ml、5 M NaCl 2 ml、1 M MgCl₂ 1ml，加ddH₂O 100 ml。
TSM2（新鮮配制）：1 M Tris-HCl（pH 9.5）10 ml、5 M NaCl 2 ml、1 M MgCl₂ 1 ml，加ddH₂O至100 ml。
顯色液（臨用前現配）：5 ml TSM2 加顯色液原液（NBT/BCIP）150 μl，并加適量左旋咪唑使其終濃度為0.24 μg/ml，避光。