實驗材料 DNA
試劑、試劑盒 霧水乙醇EDTAT4 DNA連接酶TENaCl
儀器、耗材 培養箱水浴鍋
實驗步驟
1. 用Bal 31或外切核酸酶Ⅲ及S1核酸酶在質粒的目的區域產生一嵌套式的5’或3端'缺失突變體。首先在目的序列附近用一限制酶使質粒線性化，在用Bal 31消化時，應確定其切割效率，以便弄清毎切割6~8個目的堿基對和覆蓋待誘變區所需的時間。
2. 將合成接頭與經適當時間酶切處理的DNA連接。用適當的限制酶進行切割以產生在缺失末端上帶有接頭而在另一端上含有載體位點的片段。
3. 用低熔點瓊脂糖凝膠分離目的片段，將該片段與載體片段相連，以產生帶缺失突變的完整質粒。
4. 用連接混合物轉化合適的大腸桿菌，挑克隆，小量制備質粒DNA。
5. 用限制性內切酶消化小量制備的質粒DNA，以產生一端含缺失終點的小DNA片段，進行非變性聚丙烯酰胺或篩分型瓊脂糖凝膠電泳來確定DNA片段的大小，以此說明缺失突變末端的存在。選擇適當的限制性酶以便獲得 200~300 bp 小片段。
6. 對目的區域內成套的缺失突變體測序，以確定準確的缺失終點。
7. 設計互補寡核苷醆，以恢復位于每一缺失末端的接頭與5’系列缺失體的上游限制性酶切位點之間或者位于接頭與3’系列缺失體的下游切點間的野生型序列。
8. 制備下列片段以便與寡核苷酸相連：
（1）從每個缺失突變體上切下的一段穿過接頭位點和在質粒的藥物抗性標志（促變片段）內很方便的位點的片段。
（2）從野生型質粒切下來的穿過藥物抗性位點和被誘變區域附近的限制性位點的骨架片段，分離這些片段。
9. 將每種寡核苷酸以大約100 μg/ml 的濃度重懸于含15 mmol/l NaCl 的TE緩沖液內，各種片段以等摩爾數混合，65 ℃保溫10 min。
10. 慢慢冷卻至室溫20 min，測A260以確定濃度，取小量樣品在4%的篩分型瓊脂糖凝膠進行電泳監測雜交情況。
11. 將三種成分按如下方法連接起來：促變片段和骨架片段等摩爾數混合， 加摩爾數相對質粒片段50倍過量的雜交寡核苷酸，在10 μl 總體積內，DNA總量約為400 μl。加0.4 μl T4 DNA連接酶，15℃保溫2 h。如在促變片段和骨架片段間通過平末端連接，應加1 μl 連接酶并在30℃保溫2 h。用TE緩沖液稀釋40倍至1 μg/ml。
12. 連接反應液在65℃滅活10 min，慢慢冷卻至室溫。
13. 用20~25 μl 稀釋的連接反應液轉化合適的大腸桿菌，涂布在選擇培養基上，5%的連接液可產生20~30個克隆，而且所有的克隆均有正確的結構。
14. 挑克隆，小量制備質粒DNA，通過限制性酶切消化和DNA測序驗證DNA。