一、實驗原理
用地高辛標記的HCV RNA探針檢測HCV RT-PCR產物。
二、實驗步驟
1. 處理：
將尼龍膜浸泡于20×SSC中吸足液體后，夾在兩層濾紙中37℃烘烤20-30 min。（將尼龍膜置入烤箱后立即進行下一步操作）
2. 變性：
【原理】 使DNA樣品變性，即雙鏈DNA→單鏈DNA。
將待測DNA樣品（HCV經RT-PCR擴增產物；HBV的PCR擴增產物作為陰性對照，每組兩種樣品各10μL）置于PCR儀中100℃加熱10min,立即置冰中，并置于-20℃冰箱中驟冷5min。（每一排共三組的樣品點在同一張尼龍膜上。）
3. 點樣：
【原理】 使樣品中的DNA與膜結合牢固。
將上述變性后的樣品各2μL點在尼龍膜的毛面上，室溫下風干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。
4. 預雜交：
【原理】 封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結合位點。
將雜交膜封入雜交袋中（每兩組的膜背靠背封在一個雜交袋中），做好剪角標記（勿過大）。用1000μL加樣器，加入預雜交液（Dig Easy Hyb），每組5mL全部加完，使尼龍膜恰恰漂起即可，若5mL預雜交液不足，可適當補加。除去氣泡，置42℃恒溫搖床上，輕輕振搖30min-60min. 5. 雜交液制備：用預雜交液將探針按100ng/mL濃度稀釋，即為雜交液。 （已準備好）
6. 雜交：
剪開雜交袋一個小角，傾去預雜交液，加入雜交液2-3mL,除去氣泡，封口。置50℃恒溫搖床上，輕輕振蕩過夜。
7. 洗膜：
【原理】洗去未結合的探針，否則會導致過高的本底。
（1）回收雜交液；
（2）室溫下，用2×wash solution洗膜兩次，每次5min；
（3）將0.1×wash solution預熱到50℃洗膜兩次，每次15min。
8. 封閉：
取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培養皿中浸泡1分鐘平衡后，轉入30mL BufferⅡ中，室溫作用30-60min。
【原理】封閉雜交膜上非特異性的蛋白結合位點。 （在此階段末期，準備下一步的抗體稀釋。稀釋方法：加1μL Anti-DIG-AP到10mL BufferⅡ后輕輕混勻，4℃ 可保存12h.）
9. 酶聯抗體結合：
將雜交膜封入一個新的雜交袋中，加入3mL Anti-DIG-AP/ BufferⅡ中室溫作用30min，經常搖動，使酶聯抗體與地高辛結合。
10.洗膜：
（1）取出膜，將膜放入含有30mL BufferⅠ的培養皿中，洗膜兩次，每次15min。
【原理】洗去未結合的酶聯抗體。
（2）取出膜，將膜放入含有20mL BufferⅢ的培養皿中平衡2min。
11.顯色：
（1）將45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL BufferⅢ中，（注：顯色液必需現配現用！）
（2）在10mL新鮮制備的顯色底物液中靜止避光顯色數小時，常在12h內完成顯色反應。