1.1.1 摩爾定律對454測序儀的影響
454測序儀的迅猛發展不是因為我們想要Sanger測序儀小型化，而是因為新型奔騰芯片的出現以及摩爾定律法則給我們帶來的希望。很明顯，常規的人類基因測序項目會對我們處理測序技術的能力提出更高要求，這與我們對計算機處理能力的要求是一樣的。不過，只有將計算機的電子管換成晶體管，才為后來集 成電路技術的發展提供了可能，這正是計算機產業發展的關鍵所在。而希望對傳統的毛細管電泳技術進行改良，提高它的速度和處理規模，正如只用電子管直接制作 集成電路一樣不可能。因此，如果將各種測序技術比作一個個晶體管，將一系列測序步驟整合起來比作集成電路，那么也就可以用摩爾定律來預測DNA測序技術的發展速度了。
合成測序法概念雖然在提出的時候還不算成功，但它的出現為測序儀小型化奠定了基礎。基于合成測序法出現了兩種策略：一種是循環可切除終止測序法 （cyclic reversible termination technology），即依次逐個添加熒光標記的堿基，繼而檢測熒光信號，切除熒光基團，如此往復；另一種策略是焦磷酸測序法（sequenced by detecting pyrophosphate release）。454測序儀采用的正是焦磷酸測序法，因為它似乎比第一種方法的效率更高。結果證明，454公司的選擇是正確的。454測序儀采用的是小型化焦磷酸測序反應，測序模板準備和焦磷酸測序反應步驟都是在固態芯片上完成的。
實際上，早在上世紀90年代中期，焦磷酸測序技術就已經被科研界用來進行基因分型工作了，但那時的焦磷酸測序技術還不能夠滿足標準的測序實驗要求，因為它的測序長度太短，因此只能用于旨在發現SNP的基因分型研究當中。當時進行基因分型操作時，是在微量滴定板（microtiter plate）上進行的，可以連續進行最多96次基因分型實驗，平均每個樣品花費20美分。那時焦磷酸測序還不能用于從頭測序工作，因為從頭測序需要對每一個尤其是第一個堿基都能準確地區分清楚，而焦磷酸測序只能簡單地對已知位點的堿基進行檢測，而且從頭測序要求的測序長度也是焦磷酸測序法無法達到的。
不過，由于焦磷酸測序的原理是通過檢測堿基摻入時發出的光來進行測序的（圖3），所以它并不需要類似于電泳之類的物理分離過程來對堿基進行區分。這 也就是說焦磷酸測序儀可以“縮小（減）”到只需要檢測光線就夠了，而不需要像傳統的測序儀還需要電泳設備，而這正是限制傳統電泳儀小型化的關鍵所在。發光檢測方法還能夠進行多路平行操作，但是直到454測序儀出現之前，還沒有人這樣做過，以前都是依次進行檢測的。和晶體管早期的遭遇一樣（當時人們也懷疑晶 體管替代不了電子管），人們同時對高密度的，用于并行焦磷酸測序的反應也充滿了疑問。不過，當我們不再在溶液中進行測序反應，而是將測序模板、所有的試劑 （酶）都固定在平板上制成芯片之后，就獲得了小型化的，能進行多路并行處理的測序儀，這就與晶體管被小型化并整合成集成電路的過程一樣。此外，借助微量滴定板上一個個的小孔所達到的將不同測序反應進行分隔這一目的，也能通過在單個固相支持物上進行嚴密包裹（隔離）的反應來實現。在這些各自隔絕的反應體系中，鏈聚合反應速度和發光速度都能通過對反應試劑和產物彌散狀況進行嚴密的控制來進行精密的調整。
1.1.2 新的并行試驗方法
在開發新型高通量、高并行運行方法時碰到的一個關鍵問題是，如何將反應試劑同時加入數量如此之多的各個反應體系中？在焦磷酸測序的過程當中需要反復 加入不同的堿基以供測序反應使用，而當時的自動化加樣設備無法有效地做到對這么多的反應體系同時循環加樣。于是，開發一種全新的高密度并行處理方法這一重 要課題又再一次擺在了科研人員的面前。這一次，我們找到了一個非常簡單但是又很巧妙地方法。在高密度的反應芯片表面使用層流（laminar flow）加樣方式，反應試劑會通過擴散作用很好地進入每一個反應體系，而且也可以用層流的方式洗去多余的反應試劑。現在，所有的新一代測序儀都采用了這 種層流加樣方法。
為了將每個單獨的測序反應都分隔開來，我們一開始使用平板（芯片），不過在平板上平均每一平方厘米的面積上最多只能同時進行數百至數千個反應。但我們希望達到的是在每平方厘米的面積上同時進行100萬個測序反應，這樣才能令測序儀小型化，同時節省試劑并進行快速成像和測序。為了實現更高密度的測序反 應，我們在平板上制作了很多小孔，將每個反應體系都安置在這些小孔中，這些小孔都足夠深，足以分隔每個反應體系。雖然這種方法極大提高了測序反應的密度， 縮小了平板的面積，但是要達到我們的要求還是需要60mm×60mm大小的芯片才行。
針對圖像采集問題使用了商業化的天文學照相（astrological grade camera）器材，在電荷偶合裝置（CCD）的表面連接上光纖束（fiber-optic bundle）。這些光纖是錐形排列的，這樣可以將大范圍的光信號都傳輸到CCD表面上很小的一個范圍。采取下面兩個步驟，我們就可以制成含有高密度小孔 的芯片：先將光纖束連接到類似于載玻片一樣的一次性芯片上，然后用酸蝕刻（acid etching procedure）技術在玻片的另一面打上小孔。這種酸蝕刻技術是根據制作生物傳感器的技術改進而來的。
454公司制作的每張芯片上可以達到數百萬個小孔，每一個小孔都是一個獨立的“反應站”，互不干擾，測序反應發出的光被連接在芯片上的光纖傳送到CCD記錄下來（圖4）。這種芯片就好像集成電路一樣一次可以同時處理數百萬個測序反應。這種芯片同樣也能被其它通過發光檢測技術的產品所使用。454測序儀也沒有像以前的96孔板焦磷酸測序儀那樣使用液態的試劑，而是將試劑和模板統統都吸附在一個個微珠上，然后把這些微珠一個個地放到芯片上的小孔中，每孔一個微珠。這種固定步驟不僅保證了每孔測序反應的獨立性，也極大地節省了試劑消耗費用。
要想實現高通量基因組測序，只對測序步驟進行優化還是遠遠不夠的。人類基因組計劃花費的30億美元經費中有很大一部分都用在了測序樣品制備階段。當時即使是采用最簡單的制備樣品方法也需要將目標片段克隆到細菌中，挑克隆，再轉到96孔板，然后進行克隆擴增，提取質粒，制備測序模板。這種工作流程既耗 時也耗錢。
如果采用新型的文庫制備方法就可以極大地節省這部分開支，這種新型的方法是先分離基因組DNA，隨機切割成小片段分子，然后通過有限稀釋（limiting dilution）和聚合酶擴增反應，即體外克隆方式（clones without bacterial）制備模板片段。這樣，從模板制備到最后的測序反應整個過程都能夠在體外完成。
1.1.3 從發明到創新
從概念的提出到最后技術上的實現，454測序儀主要關注兩個方面，首先是開發蝕刻光纖玻片；其次，改進焦磷酸測序方法使其能在固相支持物上進行，即將其改造成固態焦磷酸測序法，同時也對模板及文庫構建方法進行了改進，讓454測序儀能進行長片段測序工作和從頭測序工作。
1.1.3.1 在蝕刻板上的小孔中進行固態、長片段焦磷酸測序反應
蝕刻技術經過改良之后能在75mm×75mm的玻片上刻出深55μm、寬44μm的小孔。而開發固態測序方法和改良測序長度則是兩個緊密相關的問題，因為在固定的小孔中反應實際上就能改進測序質量和測序長度。由于反應試劑能迅速滲透到小孔中，因此反應速度也會加快。而且這里也沒有使用三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）提取未參與反應的堿基，而是將芯片置入反應池中通過層流液體的快速滲透作用將多余的未參與反應的堿基和反應副產品洗掉，由此得到 100bp~500bp的測序長度。在能有效去除多余堿基的同時，每輪反應中聚合酶的效率也得到了極大提高。這樣高效率的聚合反應使得454測序儀具有較長測序長度的同時也保證了高準確性，測序長度在200bp時的準確率高達99.5%。這是因為通過降低小孔中殘存的未參與反應的堿基濃度，可以降低這些堿 基對聚合酶活性的抑制作用，或者降低這些堿基導致的延后錯誤（carry-forward error，即由于未參與反應的堿基導致的測序反應不同步現象）的發生率。454測序儀在測序長度和準確率方面具有優勢還因為其在應用流體學、表面化學和 酶學（包括選擇更好的聚合酶、在更高的溫度進行測序反應以及更換及平衡各個酶組分）等方面都有創新（表4）。
還有一些能提高測序精度和測序長度的技術，不過暫時還沒有商業化產品。這些技術包括使用可切除的終止堿基（reversible terminator）提高對同聚物（homopolymers）的檢測精度；雙末端測序法（double-ended sequencing），即同一模板的兩條鏈均不測序；以及選擇性酶固定法（alternative enzyme-immobilization method）等。這些技術改進還都沒有用到測序儀產品中，有一部分原因是因為現在還沒有必要使用。
注：蜜蜂群崩潰癥（honeybee colony collapse），指的是來自養蜂業的蜂箱或自然界存在的歐洲蜜蜂群的工蜂突然消失的現象，又稱作Colony collapse disorder（CCD)。