3、為阻止Taq DNA 聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。
模式1：適用于引物<24堿基或GC含量<50%
95℃ 2分鐘。然后： 95℃ 30秒(變性)，42℃ 30秒(退火)，70℃ 1分鐘(延伸)。
模式2:適用于≥24堿基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分鐘，然后: 95℃ 30秒(變性)，70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入終止溶液之后樣品可在4℃保存過夜。
（二）、 測序凝膠板的制備
1、玻璃板的處理：
銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯于玻璃板上。這一步對于在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。
（1）短玻璃板的處理
A. 在1ml 95%乙醇，0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane)，配成新鮮的粘合溶液。
B. 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過并已經自然干燥的玻璃板，整個板面都必須擦拭。
C. 4-5分鐘后，用95%乙醇單向擦玻璃板，然后略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程，每次均須換用干凈的紙，除去多余的粘合溶液。
[注意] 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷，使凝膠不能很好地粘附。
2. 準備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。
3、防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的，否則將導致凝膠撕裂。
(2)、長玻璃板的處理
A. 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。
B. 5-10分鐘后用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。
[注意] 1. 用過的凝膠可在水中浸泡后用剃須刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10% NaOH浸泡后除去。為防止交叉污染，用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開，如果出現交叉污染，以后制備的凝膠可能撕裂或變得松馳。
2、凝膠的制備：
（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理后，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置于玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓于其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。
（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結果。配制過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2ml，并用0.45mm的濾膜過濾，然后加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻后，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制后4-6分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的 TEMED和過硫酸銨。
| 凝膠終濃度 | ||||||||
| 3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 12 | 16 | 18 | |
| 尿素(g) | 42.0 | 42.0 | 42.0 | 42.0 | 42.0 | 42.0 | 42.0 | 42.0 |
| Acr&Bis(ml) | 7.5 | 10.0 | 12.0 | 14.5 | 20.0 | 30.0 | 40.0 | 50.0 |
| 10×TBE緩沖液(ml) | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 |
| 雙蒸水(ml) | 47.5 | 45.0 | 43.0 | 40.5 | 35.0 | 25.0 | 15.0 | 5.0 |
| 10%過硫酸銨(ml) | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.7 | 0.7 |
| TEMED(ml) | 87 | 80 | 80 | 80 | 80 | 70 | 47 | 40 |
(3)膠配制好后，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合完全。
[注意] 1、使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。
2、灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。