DNA序列的正確測定，是進行基因結構和功能分析，繪制基因圖譜、轉基因檢測等方面工作的重要前提。同時DNA測序技術為快速、簡捷分析蛋白序列及結構提供了工具。
DNA序列測定技術是在DNA內切酶、合成酶的應用，基因克隆及亞克隆技術，高分辨率聚丙烯酰胺變性膠電泳技術等基礎上建立起來的。這些技術主要有三部分組成，首先為通過各種酶的應用和克隆技術獲得一組有相同起點端而終止端在長度上相差一個核苷酸的DNA片段群。其次為通過聚丙烯酰胺凝膠變性電泳，將以上在長度上差一個核苷酸的DNA片段群相互分開。最后是通過放射自顯影或化學方法將經變性電泳分開的DNA片段顯色。
目前研究人員獲得一端相同、另一端差一個核苷酸的途徑，主要是采用Sanger(1977)的酶促合成法或Maxam和Gilbert(1977)的化學降解法。在酶促合成法中，人們將待測序列的DNA片段作為模板，以與模板3'端相配對的寡聚核苷酸作為引物，利用Klenow片段、測序酶、Taq酶及AmpliTaq酶等DNA合成酶擴增與模板配對的DNA片段，在擴增過程中，同時進行四組平行實驗，每一組中含四種dNTP,和一種ddNTP，這樣經過一段時間的擴增，即可獲取分別以Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ為結尾的四組由所有可能長度核苷酸片段組成的DNA片段群。在化學降解法中，人們用專一性作用于A,T,G,C堿基的化學藥劑分別處理經內切酶切割而成的一定長度DNA片段，通過控制反應時間，既可獲得分別以A、T、G、C為結尾的四組由所有可能長度核苷酸片段組成的DNA片段群。在以上兩種方法中，除了要研究與DNA的高級結構、DNA－蛋白質結構相關性有關的序列分析時，采用化學降解法外，對于單純以測序為目的的實驗，研究人員用得較普遍的是酶促合成法，在這種方法中，可測DNA片段長度及正確性與所選用的合成酶類型關系極大(詳見附表)。在測序工作的早期階段，人們只能對ssDNA進行測序，因此在進行測序前，必須將待測片段克隆到M13嗜菌體等中，將dsDNA變成ssDNA，并同時使模板量擴增，然后再測序。而近階段，隨著PCR技術的發展，人們可以利用耐熱性Taq酶，采用不對稱PCR技術，對待測片段在體外完成單鏈片段的富集和模板擴增，從而可直接測定dsDNA序列。在酶促合成法測序中，影響測序正確性的另一重要因素為引物的選用，實驗中所使用引物一般有特異性引物和通用性引物，前者指當待測片段一端的數十個核苷酸序列已知時，即可人工合成與其相配對的一段寡聚核苷酸作為引物。后者為待測片段末端序列未知，但其末端側翼有通用型載體片段，且此載體片段為某一內切酶的酶切片段，此時即可選用與此片段配對的商品化通用型引物；另外當待測片段側翼無載體片段時，人們也可通過DNA聯接酶和內切酶的協同使用，在其末端添加上與通用型引物配對的一段寡聚核苷酸。引物的具體要求可參考附錄。模板的質量及數量也是影響測序結果的一個重要因素。
測序膠是影響測序質量(包括可讀性、可讀長度、可重復性等)的又一重要因素。不管是酶促合成還是化學降解得到的不同長度核苷酸片段，都必須通過測序膠來區分并顯示。一般通過測序膠可讀取300-400核苷酸的可靠序列，但如果在相鄰樣槽中進行時間梯度電泳，即可最多讀取500以上核苷酸的序列。測序膠的一些參數影響著測序結果，具體為：
１：膠濃度
高濃度(12-20%)的膠適合讀取引物5'端50個核苷酸以內的序列。
低濃度(６％及以下)的膠可讀取5'端400以內或更遠的核苷酸序列。
２：膠長度 40-50cm
３：膠厚度 0.4mm。小于此，膠上條帶分辨效果好，但極難操作，極易破裂；大于此，條帶分辨率下降，且膠難固定和干燥。另外，如采用上薄下厚的膠可改善條帶上緊下疏的現象。
４：緩沖液 如配膠緩沖液采用梯度性，也可改善條帶上緊下疏的現象。
５：膠板溫度：要求整個膠板溫度均一，保持在50℃上下，以防止DNA形成鏈間配對，
經膠分離后條帶的顯色，主要有同位素標記和非放標記兩種。從該技術誕生到現在，基本上都采用對核苷酸進行同位素標記，然后放射自顯影，不過，現在在標記物選用上多用35S替代32P。考慮到同位素標記的傳統測序使用限制了許多研究人員的工作。目前國外一些公司開發出了一些非同位素測序方法。如銀染測序法或地高辛標記探針測序法等。本實驗即采用銀染法進行DNA序列測定。以使學員對測序技術有一初步了解。PCR測序優點在于１)選用耐熱性和熱穩定性好的Taq酶，采用不對稱PCR直接對dsDNA片段測序。在PCR過程中采用較高的復性溫度，增加了引物與模板的特異性結合；較高的延伸溫度，防止了DNA二結結構的形成。這些保證了結果的正確性和可重復性。2)需用模板量少，ng-μg級即可。以PCR反應為基礎的齦染測序有PCR測序的優點，有不用同位素標記的長項，但也有無法克服的缺陷1)模板及引物純度要求極高，PCR反應的參數要求較嚴；2)電泳后步驟要求比較嚴，略有差錯，實驗將全盤失敗;3)，實驗對化學試劑及水的質量要求極高，實驗結果與操作經驗的相關性極大。