DNA測序可以看作是三種技術或步驟的組合:
步驟1:通常通過基于PCR的技術生成DNA片段
步驟2:通過毛細管或常規瓊脂糖凝膠電泳分離片段
步驟3:檢測步驟,最常見的是熒光檢測。
水質對每個步驟的影響將在單獨的部分中介紹。
這里簡要介紹了水質的影響。用于操作DNA測序儀的水質應符合某些質量標準,以優化測序過程。
無核酸酶的水
建議使用無核酸酶的水,以避免在DNA測序的所有步驟中DNA降解。使用超濾設備可以有效地去除核酸酶(請參閱無RNase的水部分)。使用點超濾濾芯可以安裝在凈水系統的出口,以根據需要提供無核酸酶的水。
有機物
有機物是DNA測序中最具破壞性的污染物。實際上,有機物的高負載會損害毛細管內部或較大凝膠中的凝膠電泳過程。天然物質降解產生的大型有機酸,例如腐殖酸和富里酸,在電泳過程中可能與DNA片段共洗脫,并且在PCR步驟中也會干擾聚合酶的效率。另外,更常見的是,某些有機物會干擾熒光檢測并導致所分析目標DNA測序的錯誤。實際上,大多數測序技術都是基于對附著在DNA片段上的熒光染料的檢測。熒光吸收和猝滅有機分子的存在會干擾檢測。
為了確保用于DNA測序的高純水的有機純度,建議使用總有機碳含量較低的有機碳,即總有機碳(TOC)。在高純水凈化系統中,TOC的規格<5 ppb(μg / L)。
離子
在PCR步驟中,需要仔細調節某些離子(例如鎂)的含量,以優化聚合酶的效率。必須除去其他離子,鎘和一些其他二價陽離子,以防止抑制聚合酶。當所用的水具有高純度且不包含未知濃度的離子時,也可以最好地獲得和控制電泳過程中所需的離子力。
高電阻率(18.2MΩ?cm)確保水中的離子含量低(總離子濃度低于1 μg / L)。高純度水凈化系統旨在按需提供連續的高電阻率水。
細菌
細菌可以在水中釋放核酸酶,因此,應將其去除以避免核酸降解。細菌還會釋放出可能干擾目標DNA片段電泳分離的DNA。另外,如前所述,細菌會釋放離子和有機物,這兩種污染物都會干擾DNA測序。
通過在整個凈化過程中結合技術和維護建議,可以使用水凈化系統控制細菌的水平。膜技術,絕對微濾或超濾為0.2 μm,可在交貨時去除細菌,并確保細菌水平<0.1 cfu / mL。254 nm的殺菌紫外線。
總體而言,在測序步驟中,水質應符合以下標準:
無核酸酶
高電阻率(18.2MΩ?cm)
有機物含量低(TOC<5 ppb)
低細菌數(<1 cfu / mL)
DNA測序儀制造商還使用水來制備毛細管。水質對于該步驟很重要,盡管科學家在購買設備時對毛細管制備沒有太多控制。