DNA片斷的酶切技術

限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶,這類酶的發現和應用促進了以DNA重組為基礎的生物工程技術的迅猛發展。該類酶是體外剪切基因片段的重要工具，基因物理圖譜的繪制、核苷酸序列的測定、基因片段的重組，重組子的篩選、探針的制備及各種雜交、測量基因的拷貝數,基因文庫構建,分子標記等都離不開限制性內切酶的應用。另外以限制性內切酶為基礎的各種限制性內切酶片段長度多態性分析，促進了分子遺傳學、分類學等相關學科的應用和發展。可以這么說，沒有限制性內切酶的發現和應用就沒有現代意義上的分子生物學、分子遺傳學，也就不會有任何基因工程產品。而對于從事分子生物學或相關領域研究工作的人員講來，如果不能很好地了解和掌握內切酶技術，那就根本不可能開展這方面的任何工作。

本部分實驗主要通過EcoRⅠ，Hind III兩種限制性內切酶對λDNA的單酶切、雙酶切及部分酶切的操作，使學員能掌握內切酶的實驗操作技術

一：儀器：

離心機 、 恒溫水浴 、取液器、 電泳儀 、電泳槽、 紫外觀測儀

易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

二：試劑

EcoRⅠ,Hind Ⅲ,λDNA/HindⅢ及λDNA/EcoRⅠ 標準質粒（或其他DNA樣品）（濃度>0.5μg/μl） TAE緩沖液

三：操作

(一)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ單酶切及雙酶切

1, 取２支干凈、滅菌新Eppendof管，分別按下表加入

Ａ(μl) B(μl)

滅菌水１3１3

EcoR Ⅰ緩沖液２

Hind Ⅲ緩沖液２

λDNA （或質粒DNA ） 4 4

EcoR Ⅰ１

Hind Ⅲ１

總體積２０２０

２，37℃保溫１－4小時

3，保溫結束后65-70℃10min滅活酶(如為熱穩定性酶,則用氯仿抽提)

4，取2μl左右的反應液加入2μl電泳加樣緩沖液，電泳
（二）EcoR Ⅰ、Hind III雙酶切

1,取一支干凈、滅菌Eppendof管，按下表加入各種試劑

加入試劑體積（μl）

滅菌水 1２

MULT buffer 2

λDNA（或質粒DNA） 4

EcoRⅠ１

HindⅢ１

總體積 2０

２，37℃保溫１－２小時

３，保溫結束后65-70℃10min滅活酶(如為熱穩定性酶,則用氯仿抽提)

４，取2μl左右的反應液加入2μl電泳加樣緩沖液，電泳

注意：１，樣品加入次序為水、緩沖液、DNA最后為酶，不應顛倒，

２，加酶步驟要在冰浴中進行，在加酶前應先將水、緩沖液及待切DNA混勻

３，反應體積中水的量要盡量少，即反應體系的體積要盡量少，一般水解0.2-1ug模板DNA時，應將體積控制在20－30ul內。但要保證所加酶的體積不高于總體積的1/10,因為限制性內切酶是保存于50%甘油中的，如加酶體積高于總體積的1/10,則反應液中甘油濃度將大于５％，而此濃度將抑制內切酶活性。

4，為了控制反應體積和促進反應進行，要求模板DNA的濃度應很高，否則反應體系中DNA濃度太低則將引起酶反應動力學改變、降低酶解效果，此時不得不增加反應體積；而一般為了增加DNA儲藏的穩定性，DNA多保存在TE緩沖液中，如反應體系中過多加入模板DNA溶液則勢必造成反應體系中EDTA濃度升高，而對酶產生抑制。因此如底物DNA濃度過低則應進行濃縮。

5，本實驗中雙酶切時，因兩種酶的緩沖液鹽濃度要求相同，所以，可在同一反應體系中完成雙酶切。但如進行雙酶切時，兩種酶所需緩沖液鹽濃度要求不同，則不能將兩種酶同時加入同一體系，進行反應，此時可采取下列處理辦法

a:先用在低離子強度的緩沖液中活性最高的酶切割DNA，然后加入適量的NaCL及第二種酶，繼續保溫。

b:使用所有限制酶均可作用的單種緩沖液(谷氨酸鉀緩沖液)。

C:一種酶水解完后，進行有機溶劑抽提，沉淀、干燥后再復溶然后進行第二種酶切。

在上述3種方法中遇到最多的可能為C

6，在水解結束滅活酶時可采用65℃加熱10分鐘或加EDTA至終濃度10mM，二者各有利弊，加熱簡單但對有些酶滅活不徹底。EDTA對酶的滅活徹底，但EDTA存在將使連接反應變得極為困難，因此在連接前要求重新用有機溶劑抽提，這將增加操作難度和導致DNA的損失。