一、目的與原理
DNA酶切片段的聯接是兩DNA片段相鄰的5‘磷酸和3’羥基間可有連接酶催化形成磷酸二酯鍵，這個連接反應在體外一般都有大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶催化，但是分子生物學試驗中主要采用T4DNA連接酶，因該酶在正常條件下，即能完成連接反應。本實驗擬通過T4DNA連接酶對酶切片斷的連接操作，掌握這一DNA片段的連接技術。
二、材料和方法
1． 儀器
離心機，恒溫設備，真空干燥機，取液器
2． 試劑
T4DNA連接酶，10×T4DNA連接酶緩沖液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚，TE緩沖液，電泳緩沖液、3M NaAc
三、操作步驟
取干凈、滅菌新Eppendorf管，按下表加入各試液
試液 體積（μl）
T4DNA連接酶緩沖液 1.5
λDNA 10
ATP 1
無菌水 1.5
連接酶 1
總體積 15
19--20℃ 保溫2小時，提取已連接好的DNA片段。電泳分析。
四、結果 （略）
五、注意事項
1、 該實驗用的T4DNA連接酶最適反應是37℃，但該溫度下DNA退火效率低，連接效率還不如22℃高。
2、 如果要檢驗連接酶和連接酶專用的緩沖液是否有效，可重新連接酶切后的λDNA。若連接成功，則說明有效。