DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發現的，最初是在大腸桿菌細胞中發現的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。
