DNA酶I足跡分析法實驗2

含有DNA結合位點的質粒DNA

適當的限制性內切核酸酶100%乙醇及冰冷的70%乙醇TE緩沖液[α-32P] dNTP (3000?6000 Ci mmol)水溶液1O× Klenow片段緩沖液E. coli DNA聚合酶1的Klenow片段5 mmol L 4dNTP 混合液脫氧核糖核酸酶I (DNA酶I; EC3.L4.5)分析緩沖液A或B干冰DNA酶I終止緩沖液DNA酶I儲存緩沖液甲酰胺加樣緩沖液

10 mL 一次性塑料管硅烷化1.5 mL微量離心管可調節水浴鍋（±0. 1℃)12 in×7.5 in大小的玻璃或不銹鋼碟有蓋子的塑料微量離心管6 mm寬間隔12 mm的DNA測序膠梳平頭Hamilton注射器（29-G 用于0.4 mm膠）

1) 用膠片掃描裝置構建一個該膠片的二維數字圖像。

2) 對每個結合位點的被保護DNA區帶，在每條泳道 上（也就是各配體的每一濃度）的光密度進行積分。

最好是將連續的條帶群作為單獨一組（即圖中的方塊）來分析。只要所有被包括在內的條帶均勻地出現，這種簡化是合適的。在所有的泳道上密度最大而且密度較相似的條帶之間的最低密度處（也就是高度保護區）畫出邊界以選定各方塊的兩端。很關鍵的是，膠片的每泳道中各方塊內都含有完全相同的條帶。

3) 為膠片局部背景光吸收而校正各泳道中的各方塊的光密度積分值。可用圖像分析軟件進行如下計算：

a. 在各方塊所在位置上，選定各泳道之間空白處的中心，定義小長方形

b. 計算各小長方形中的像素光密度值的直方圖，將概率最高的像素光密度值定義為局部背景。

c. 對于每方塊和每泳道，分別算出泳道每側的平均背景值。

d. 將該平均值乘以方塊中的像素數目。

e. 從光密度積分值中減去所得值即得到該方塊中的光密度積分校正值。

4) 將各組結合位點的校正光密度積分值對該泳道中的總DNA值進行標準化。

a. 選擇1個或多個方塊，除去滴定點及非常高敏感的區帶，來代表泳道中的DNA總濃度。

b. 按步驟2及步驟3測定這些標準塊的光密度積分校正值。

c. 計算每組結合位點的光密度比值（Dsite/Dstd)。如果選擇不止一個標準組（方塊），則將其和作為Dstd。

選擇兩個大標準塊較為實際，也足夠了。其中一個靠近電泳起始處而遠離結合位點， 另一個則在離起點更遠處。仔細檢查每個標準塊內配體濃度依賴性的系統誤差，這種誤差可導致標準無效。

5)將OD比值按以下公式換算成保護分數值（f):

f= 1-( Dn, site/Dn,std)/ ( Dr, Site / Dr, std )

式中，n為確定蛋向質配體濃度的任一電泳道；r為參考泳道（每個實驗都必須設置）， 其中在反應混合物中不加蛋白質配體。用各組結合位點的/值對蛋白質配體濃度制作結合曲線。

如果按所述的方案做，而對照實驗（Brenowitz et al.，1986a,b)顯示DNA酶I的作用對蛋白質-DNA結合平衡常數無影響，f值就達到了飽和分數值（F)。能觀測到的f值往往不能覆蓋全程（0?1)。其原因之一是無法在加DNA酶I之前計算DNA的切口 (也就是，即便在飽和配體濃度時，Dn,siK>0。因此，在分析數據時，最好將f值定義為與結合曲線成正比的轉換曲線，將兩條曲線的極限值U和f分別為上限值和下限值）作為可調節參數。

對于單結合位點或相互之間無協同作用的多結合位點，其結合曲線為Langmuir等溫線.