【實驗原理】
1．DNA重組技術
重組DNA(Recombinant DNA)技術是遺傳工程的核心技術，也是人類在基因和DNA分子水平進行操作的技術。它包括以下幾個步驟：
1）重組DNA分子的構建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應用TA克隆方法,將PCR擴增產物快速克隆至質粒載體中。該方法利用了PCR過程中使用的熱穩定聚合酶(Taq酶)在所復制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸(A),從而產生一A-粘性末端的性質,設計一種線性載體,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR產物,在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子。
2）將重組DNA分子轉化宿主細胞。
3）克隆選擇增殖：將轉化后的液體涂布于瓊脂培養基表面，培養基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應抗生素的抗性基因，轉化的細菌能在培養基上生長形成集落。挑取菌落，置液體培養基中培養，得到大量含重組DNA的細菌。
4）收獲擴增后的培養細胞，提取重組DNA分子（質粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。
2．質粒DNA的小量制備
常見的質粒DNA提取方法有簡易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。本實驗采用的是堿裂解法，堿裂解法的原理：在PH
12.0~12.6堿性環境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環質粒（CC）DNA仍為自然狀態。將pH調至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯形成不溶性網狀結構。大部分染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍為可溶狀態。通過離心，將可去除大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收質粒DNA。
3．質粒DNA的限制性內切核酸酶（限制酶）切分析
限制酶存在于原核生物體內，根據其結構和功能特性分為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切點不固定，Ⅲ型其切割位點在識別位點之外，只有Ⅱ型其特異性切點位置可以控制和預測，可以產生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均為Ⅱ型限制酶。這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈DNA分子上的特異性核苷酸序列的能力，能在這個特異性核苷酸序列內切斷DNA雙鏈，形成一定長度和順序的DNA片段。選擇合適的限制酶對重組的環狀質粒進行酶切，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用已知相對分子量的線狀DNA（DNA分子量標志）及未經酶切的重組環狀質粒為對照，可以對重組環狀質粒中的目的DNA分子進行初步鑒定。
【實驗用品】
1．PCR擴增儀；恒溫振蕩培養箱；超凈工作臺；細菌恒溫培養箱；臺式高速離心機；電熱恒溫水浴箱；冰箱；電泳儀； 電泳槽，樣品槽模板（梳子）；紫外燈；保鮮膜；一次性塑料手套；凝膠自動成像儀。
2．三角燒瓶（500ml, 250ml,100ml）,培養皿，玻璃試管，試管塞，玻璃棒，酒精燈，鑷子，脫脂棉，紗布，乙醇，容器盒。
3．微量加樣器（1000μl,200μl，20μl）；Tip頭（1000μl,200μl，20μl）。Tip頭盒（1000μl,200μl，20μl）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。Parafilm，透明膠帶。
4．DNA重組相關試劑：
1）Taq DNA聚合酶，緩沖液，dNTP，特異性引物，靶DNA；凝膠回收試劑盒；TA克隆載體：pMD18-T；感受態細菌；氨芐青霉素（100mg/ml）。
2） LB培養基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉 10g，10N NaOH調pH至7.0定容至1L。15磅高壓消毒，4℃保存。
3）LB瓊脂培養基：15g瓊脂粉溶于1000ml LB培養基，15磅高壓消毒備用。
5．質粒提取試劑：
溶液Ⅰ(10×)：0.5M葡萄糖；0.25M Tris-Cl (pH8.0)；0.1M EDTA，10磅高壓消毒，4℃保存備用.
溶液Ⅱ:0.2N NaOH;1%SDS 室溫貯存，即用即配。
溶液Ⅲ:3M NaOAc(pH4.8) 10磅高壓消毒,室溫貯存。
RNA酶 A: 10mg/ml
TE緩沖液：10mM Tris-Cl (pH7.6)，1mM EDTA(pH8.0)
6．質粒DNA的限制性內切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳相關試劑：
限制性內切酶Hind Ⅲ、XbalⅠ及酶反應所需緩沖液；瓊脂糖；溴化乙啶貯存液（10mg/ml）；6×載樣緩沖液。
Tris-乙酸(TAE)貯存液：
50×：242克Tris堿，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
加水至1L