DNA降解斷裂法檢測腫瘤細胞凋亡

腫瘤細胞

PBS 裂解緩沖液 苯酚 氯仿 異戊醇 乙醇 氯化鈉 TE緩沖液 TAE TBE 瓊脂糖凝膠電泳 磷酸-檸檬酸緩沖液 蛋白酶K R Nase酶 細胞消化液 EDTA

離心機 紫外分光光度計 電泳儀 離心管 燒杯 玻璃棒 量筒

一、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb。

二、甲酰胺解聚法：破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

三、玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。

四、異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態）

五、表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

六、加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應。

七、堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心后取上清，含少量DNA。

影響瓊脂糖凝膠電泳DNA遷移率的因素：①DNA分子大小，DNA分子越大遷移速度越慢。②遷移率與瓊脂糖濃度成反比。③DNA構象：a.相同分子量的超螺旋環狀（Ⅰ型），切口環狀（Ⅱ型），線狀（Ⅲ型）DNA，以不同速率通過凝膠。b.一般情況下，遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④電壓：遷移率與所加電壓成正比，但是電壓過大有效分離范圍減小。⑤電場方向：單一方向速率均等，改變方向，極大分子DNA遷移更慢。通過脈沖電場凝膠電泳分離極大DNA。

通常與已知分子量的標準DNA片段一起電泳，經比較可獲知DNA標本大小。如條帶拖尾，系加入DNA量太多或凝膠未制好。若DNA分子量小或一片模糊，表明DNA有降解。