| 實驗方法原理 | 當DNA 的稀鹽溶液加熱到80～100 ℃ 時, 雙螺旋結構即發生解體, 兩條鏈分開, 形成無規線團。一系列物化性質也發生改變: 260 nm 區紫外吸收值增高(增色效應) , 粘度降低, 浮力密度降低等。DNA 的變性的特點是爆發式的, 變性作用發生在一個很窄的范圍。通常把DNA 的雙螺旋結構失去一半時的溫度稱為該DNA 的熔點或熔解溫度( melting temperature ) , 用Tm 表示。DNA 的Tm 值一般在70～85 ℃之間。 DNA 的Tm 值大小與下列因素有關:
1. DNA 的均一性。均一性越高的樣品, 熔解過程越是發生在一個很小的溫度范圍。 2. G-C 的含量。含量越高, Tm 越高, 由Tm 值可推算出GC含量。其經驗公式為: ( G-C)% = ( Tm - 69.3 ) ×2.44。 3. 介質中的離子強度。一般離子強度較低的介質中DNA的熔解度較低, 熔解度的范圍也較寬。 Tm 值的測定與變性條件的研究可為我們提供有關DNA 核苷酸組成的信息, 同時也有助于判斷DNA 的純度與數量。 |
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| 實驗步驟 | 1 . 用循環恒溫裝置測Tm
按操作規程打開紫外分光光度計預熱20 min。設定循環恒溫裝置于25 ℃ , 進行光吸收的初步測定。若是自制DNA, 先于25 ℃測其A260 , 用標準氯化鈉-檸檬酸溶液稀釋至A260 = 0.4。并注意使其終體積適合于比色杯( 1 ml或3 ml)。
以標準氯化鈉-檸檬酸溶液調整260 nm 下光吸收零點。然后將裝有待測的稀釋DNA 溶液的比色杯置于分光光度計
的樣品室中, 平衡3 min 后測A260 。再將溫度升高到50 ℃ , 取出比色杯將其內壁的氣泡趕出,測A260 。繼續升溫到80 ℃ , 平衡5 min 后測A260 。 按每次升高2 ℃ 的方式升溫, 然后平衡溫度( 5 min ) , 記錄A260 。按此方式一直進行到A260 不再升高為止。
2 . 用恒溫水浴裝置測Tm
最少設定6 個恒溫水浴裝置( 50 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃) 。按操作規定預熱紫外分光光度計20 min。 DNA 溶液的濃度控制在A260 = 0.4。取試管( 最少8 支) , 向其中各加入3 ml DNA 溶液, 蓋上帽子, 溫育15 min。其中一支試管放室溫, 兩支試管放100 ℃ , 其余溫度水浴各一支, 溫育完后迅速冷卻試管, 室溫和100 ℃一支置于冰浴10 min , 而另一支100 ℃則緩慢冷卻到室溫。
測定各管DNA 溶液的A260 , 而緩慢冷卻的那支試管在室溫下至少放置1 h 再測。
3 . 結果處理
計算各溫度下的A260 ( t)/ A260 ( 25 ℃ ) , 并以此比值對溫度作圖,連接各點成平滑曲線, 估計出光吸收增加的中點, 此即Tm 。計算G-C%含量。 展開 |
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