1、說明
DRG公司的瘦素酶免試劑盒可用于人血清和血漿中瘦素的定量檢測。此檢測試劑盒僅供體外診斷用。
2、實驗原理
DRG公司的瘦素酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應板上的微檢測孔包被有能結合瘦素分子上獨特抗原位點的單克隆抗體。一份含有內源性瘦素的病人樣本在包被孔中與特異性兔抗瘦素抗體進行孵育，之后就會形成一個夾心復合物。孵育后，用洗滌液洗去未結合的物質，再加入過氧化物酶標記的抗兔抗體以檢測結合在包被板上的瘦素的量。加入底物溶液后，顯出的顏色強度與病人樣品中瘦素的濃度成正比。
3、試劑盒成分
1) 包被板，12×8孔，可拆，微孔中包被了抗瘦素抗體（單克隆）
2) 標準品（0-5），6支 凍干型0.5mL，濃度：0,2,5,25,50,100ng/ml，內含0.3%的Proclin防腐劑
3) 質控品， 2支，200ul，即用，2個濃度（低與高），具體數值與范圍請見試劑瓶標簽或QC質控單。內含0.3%的Proclin防腐劑。
4) 實驗緩沖液，1支，11ml，即用，內含0.3%的Proclin防腐劑
5) 抗血清，1支，11ml，即用，單克隆瘦素抗血清，內含0.3%的Proclin防腐劑。
6) 酶復合物，1支，11ml ，即用，辣根過氧酶標記的抗兔復合物，內含0.3%的Proclin防腐劑
7) TMB底物液，1支，14ml，即用
8) 終止液，1支，14ml，即用，內含0.5M的H2SO4，避免接觸終止液，以免刺激皮膚或灼燒皮膚。
9) 洗滌液(40×)，1支 30ml
注：零標準品應視需要而定。
4、實驗所需器材（但試劑盒不提供）
1) 酶標儀 （450±10nm）（如DRG 公司的酶標儀）
2) 精確取樣槍
3) 吸水紙。
4) 蒸餾水
5、貯存條件
未開啟的試劑在2—8℃下貯存，在有效期內可以保持活性。不要使用過期試劑。酶聯物、底物溶液、標準品和零標準品必須在2—8℃下貯存。
微孔反應板必須在2—8℃下貯存。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴封起來。
6、樣品采集
1） 血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下離心分離血清。未完全凝血前請勿離心，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長的凝血時間。
2） 血漿：將全血采集到含有抗凝劑的離心管，采集后立即離心分離。
3） 樣品的儲存：實驗開始前應用蓋子將樣品密封好，2-8℃下可存放24個小時，如實驗之前需將樣品貯存更長的時間，應當將樣品凍存于-20℃的環境下，并且只能凍存一次，不能反復凍存。解凍的樣本在實驗之前必須要上下倒置幾次。
7、樣品的稀釋：
在第一次實驗中，要是樣品的濃度高于最高標準品，則樣品應用按實驗步驟所描述用零標準品進行稀釋，并重新檢測。并且在計算濃度時需乘上此稀釋因子。
例子：
a） 按1：10稀釋： 10μL的血清+90μL的零標準品（充分搖勻）。
b） 按1：100釋稀：10μL按a）稀釋的血清+90μL的零標準品（充分搖勻）
8、實驗步驟
所有的標準品、質控品和樣品都必須做雙份檢測以確保所有的檢測條件都一樣。每一次實驗都有一條標準曲線。
1）將所需數目的板條置于板架上。。
2）用一次性吸嘴將標準品﹑質控品和樣品分別15μL加入相應的檢測孔中。
3）每孔加入100μL的檢測緩沖液。
4）充分混合10秒，在此步驟中充分混合非常重要。
5）室溫下溫育120分鐘。
6）快速棄去檢測孔中的內含物，每孔用300μL洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和精確度。
7）每孔加入100μL抗血清。
8）在室溫下溫育30分鐘。
9）快速棄去檢測孔中的內含物，每孔用300μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。
10）每孔加入100μL酶聯物。
11）在室溫下溫育30分鐘。
12）快速棄去檢測孔中的內含物，每孔用300μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。
13）每孔加入100μL底物液。
14）室溫溫育15分鐘。
15）每孔加入50μL終止液以終止酶反應。
16）在加終止液后10分鐘內于450±10nm處讀取OD值。
9、結果計算
1) 計算每個標準品、質控品和病人樣本的平均吸光度值。
2) 用吸光度值作為縱坐標（y），濃度值作為橫坐標（x），以每個標準品的吸光度值對其相應的濃度值進行標繪，作一標準曲線。
3) 用每一樣品的平均吸光度值在標準曲線上確定其相應的濃度。
4) 自動計算方法：在IFU上，它用四參數曲線已自動計算出結果。其它的歸納方法可能會得出稍微不同的結果。
5) 樣品的濃度可直接從標準曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于最高標準品的必須用進行進一步的稀釋。在計算樣品濃度時就應當把此稀釋因子考慮進去。
10、參考值
我們強烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值。以下結果是以一定量正常人群的血液樣本為準得出的實驗結果：
人群 | ng/ml |
男性 | 3.84 ± 1.79 |
女性 | 7.36 ± 3.73 |
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。