DigitalPCR技術的發展與應用（一）

dPCR發展歷史

1992年，Sykes等從非淋巴細胞和正常體細胞背景中鑒定突變的白血病細胞，檢測了復雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因。該研究中提出了三個重要的原則：有限稀釋、終點信號的有或無及對數據泊松分布的統計處理，為以后dPCR的發展奠定了基礎。

1997年，有研究利用玻璃毛細管作為載體進行PCR反應，可以對模板分子進行定量，驗證了Taq-Man探針可以檢測模板單分子，尤其在微小的反應體系中，發展了單分子定量技術，為dPCR單模板擴增提供了技術支持。

1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W. Kinzler正式提出了dPCR的概念，他們在結腸癌患者糞便中檢測KRAS基因突變時，首先把樣本分配到384孔板中，然后分別用不同熒光檢測突變基因和正常基因，通過計算突變基因和正常基因的比例來得出突變率。

2003 年 Dressman 等 發 明 了 一 種BEAMing 方法(珠子、乳劑、擴增與磁力) 。BEAMing 將模板、引物、PCR 試劑和磁珠的混合物分至小滴中，其中大多數的小滴不含有或只含有一個模板。PCR 完成后，其中擴增產物會通過生物素——鏈酶親和素的鍵合關聯在磁珠上，乳化物隨之會被打散，珠子就能通過與檢測寡核苷酸和流式細胞儀的雜交物所讀取。

2006年 Fluidigm公司推出了第一臺基于芯片的商品化數字PCR系統。隨后，QuantaLife 利用油包水微滴生成技術開發了微滴式數字PCR技術。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收購，其微滴式數字PCR儀產品更名為QX100型號儀，2013年該公司又推出了升級型號QX200。2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D數字PCR系統。

商業化數字PCR平臺的概述

基本原理

dPCR的原理是將含有核酸模板的標準PCR反應體系，平均分配成上萬個和數百萬個PCR 反應，分配到芯片或微滴中，使每個反應中盡可能含有一個模板分子，進行單分子模板PCR反應，利用標記的探針檢測特定的靶序列,通過讀取熒光信號的有或無，計算兩種信號類型的反應單元比例和數目，經過統計學泊松分布的校準進行絕對定量。

根據數字PCR 反應單元總數和有熒光信號的單元數以及樣品的稀釋倍系數,就可以得到樣本的最初拷貝數(濃度)。

不同于 qPCR對每個循環進行實時熒光測定的方法，dPCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集，最后根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度。

根據大量獨立反應單元實現方式的不同，dPCR又細分為基于液滴式微流控（droplet microfluidics）的微滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和基于芯片式微流控的微陣列芯片式數字PCR（chip digital PCR，cdPCR）。

微流控芯片數字PCR

隨著微流芯片技術的發展，數字 PCR 借助微流芯片，可以把樣本準確并且快速的分成若干個獨立的反應單元，各個單元之間互不影響，可以多步反應同時進行。提高反應通量的同時也降低了反應消耗成本。目前Fluidigm公司的Bio-Mark ^TM 基因分析系統，Life Technologies公司QuantStudio ^TM 3D數字 PCR系統均均為采用微流控芯片技術的數字PCR系統。