ELISA雙抗體夾心法

操作步驟

1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。

2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。

3.加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

4.加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

5.終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O?D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔O?D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

1.　試劑

（1）　包被緩沖液（PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液）:

　　　　　　Na2CO３ 1.59克

　　　　　　NaHCO３　 2.93克

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

（2）　洗滌緩沖液（PH7.4 PBS）：0.15M

　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克

　　　　　　Na2HPO４?12H2O　 2.9克

　　　　　　NaCl　　　　　　 8.0克

　　　　　　KCl　　　　　　　0.2克

　　　　　　Tween-20　0.05％ 0.5ml

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

（3）　稀釋液：

　　　　　　　牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

　　　　　　　加洗滌緩沖液至100ml

　　　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用。

（4）　終止液（2M　H２SO４）：

　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。

（5）　底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:

　　　　0.2M Na２HPO４（28.4克／L） 25.7ml

　　　　0.1M 檸檬酸（19.2克／L）　　　　　 24.3ml

　　　　加蒸餾水50ml。

　　　TMB（四甲基聯苯胺）使用液:

　　　　TMB（10mg／5ml無水乙醇） 0.5ml

　　　　底物緩沖液（PH5.5）　　　 10ml

　　　　0.75％H２O２　　 　 32μl

（7）　ABTS使用液:

　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg

　　　　底物緩沖液（PH5.5）　 1ml

　　　　3％H２O２　 　 2μl

　　　抗原、抗體和酶標記抗體。

　　（9）　正常人血清和陽性對照血清。

2.器材:

（1）　聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

（2）　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。