ELISA法檢測的影響因素及其對策（一）

酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一種特殊的試劑分析方法，在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術，其試劑易于保存、結果判斷較為客觀，是目前實驗室檢測抗原抗體最經濟、最普遍的試驗診斷方法。其原理是將抗原(抗體)結合到固相載體表面，再將待測抗體(抗原)、酶標抗原(抗體)與固相抗原(抗體)結合形成免疫復合物，經洗滌使免疫復合物與待測抗體(抗原)呈比例，加入酶反應底物使其與固相上的酶反應變色，根據顏色做定性或定量分析，得出檢測結果。ELISA 法步驟包括標本的采集、保存、加樣、溫育、洗板、顯色、比色以及結果判斷，臨床采集待檢樣本過程中常出現溶血、黃疸、脂濁，類風濕因子、高濃度非特異性免疫球蛋白、藥物及血液抗凝劑等亦對結果產生一定影響。雖然操作簡單，但還是需要注意一些因素的影響，試劑的選擇、正確的操作、優良的儀器都與檢測結果密切相關。本文根據樣本的影響因素及操作流程中可能出現的相關問題展開筆述，對ELISA法檢測的影響因素及相應對策作一綜述，希望提高ELISA法檢測的準確性。

臨床采取空腹抽取靜脈血清作為 ELISA 檢測標本，標本采集過程中很多因素可能導至檢測結果不準確，如溶血、脂濁、類風濕因子、甲胎蛋白、高濃度非特異性免疫球蛋白、藥物、血液抗凝劑及細菌污染等。

1.1 溶血

溶血時紅細胞破裂釋放出具有過氧化物酶活性的物質干擾試驗結果出現假陽性，孫輝等通過實驗報道樣品溶血血紅蛋白濃度不大于4.95g/L，對雙抗原夾心法、間接法、競爭法、捕獲法檢測結果均無影響。徐傳國認為溶血易導至弱陽性標本漏檢，黎學東等認為雖然溶血會對 HB-sAg 檢測造成假陽性影響，但是小于 8g/L 時可以檢測；王紅等使用不同的干擾物濃度及分析方法得出結論，隨著溶血程度的增高 HBsAg 檢測OD值有輕微增高趨勢；但是溶血檢測抗-HIV 無影響。

臨床工作中無法采集到無干擾物血清或因操作因素導至標本出現溶血時，評估標本干擾物含量及標本處理情況，在有效范圍內進行ELISA檢測，對于溶血標本可先測定血漿 Hb 含量，不大于5g/L 時可用于 HBsAg 的檢測，超過此范圍的陽性標本最好做復檢，避免假陽性結果發生。目前也有通過增設試驗孔的方法來處理輕度甚至重度溶血標本的檢測，使溶血造成的假陽性結果得到糾正，且有非常顯著性統計學意義。

1.2 脂濁

孫輝等通過實驗報道乳糜樣品含福爾馬肼濁度小于 1460FTU 的乳糜時，對雙抗原夾心法、間接法、競爭法、捕獲法的檢測結果均無影響。汪建國等認為脂質顆粒會黏附在反應孔內壁，使吸光度 A 值增高出現假陽性；徐學新等認為不同程度的乳糜血液隨著放置時間的延長 OD 值下降，導至不同程度的漏檢。雖然可采取高速離心的方法可將乳糜微粒去除，此過程可能對檢測結果帶來影響，然而盲目采取高速離心等方法試圖去除干擾物并不可取。

1.3 黃疸

結合膽紅素濃度不大于 344μmol/L 對雙抗原夾心法、間接法、競爭法、捕獲法的檢測結果均無影響，超過濃度的樣本應重新采集，對于黃疸病人為保證檢測結果的可靠性可選擇其他檢測方法。

1.4 類風濕因子

在類風濕患者及健康者血清中常含有類風濕因子 (RF)，RF 為一種抗人或動物變性免疫球蛋白 IgG 的自身抗體，與 IgG 分子 Fc 片段抗原決定簇結合，常見的有 IgM、IgA、IgG、IgE型，均能與變性 IgG 抗體產生非特異性結合，在ELISA 檢測抗原的試劑盒中，RF 可與固相包被的表面抗體的 Fc 片段及酶標記物中免疫球蛋白結合。研究表明高濃度的類風濕因子可引起 ELISA檢測抗原檢測出現假陽性結果，類風濕因子可與固相上包被的特異性抗體 IgG 及隨后加入的酶標特異性抗體 IgG 結合出現假陽性結果。穆海霞等研究報道高濃度 RF(＞500IU/ml)對 ELISA 檢測HBsAg 產生假陽性結果較明顯，且與 RF 濃度無顯著相關性。

在臨床工作中，若出現乙肝兩對半少見模式，如僅 HBsAg 陽性，應結合患者病史并采用其他方法如微粒子酶免疫法進行復檢，慎重報告。

1.5 抗體、補體

人類血清中含有天然異嗜性抗體，而異嗜性抗體可通過交聯固相和酶標的單抗或多抗產生假陽性結果。來自哺乳動物的固相抗體及酶標二抗可激活人體補體系統，在反應過程中抗體分子結構發生變化，暴露補體的結合位點，產生假陽性結果，也可能固相抗體因為活化補體的結合導至抗原抗體的表位結合能力下降，出現假陰性結果。研究報道高濃度的乙型肝炎表面抗體會引起 HBsAg 檢測出現假陰性結果，臨床需注意避免攜帶污染造成檢測結果錯誤。

1.6 血液保存液

志愿者獻血一直是各醫院血站血液的主要來源方式，低濃度標本的檢測對輸血安全至關重要，按照《獻血者健康體檢要求》和《血站實驗室質量管理規范》，獻血者需檢測抗-HIV、抗-HCV、HBsAg、梅毒抗體等，且必須建立初次有反應標本的復檢程序，常采用抗凝試管血和采血導管血同時復檢，然而不規范的操作常導至試管標本和末端血袋管混入血液保存液。血液保存液成分、pH值、離子強度等影響均可能導至檢測結果錯誤。血液保存液對 ELISA 法檢測抗-HIV 結果影響明顯，能明顯減低試劑對抗-HIV 的檢測能力，造成假陰性結果；也有研究報道，血液保存液對HBsAg、梅毒抗體、ALT弱陽性試管標本及血袋管標本檢測結果影響有統計學意義，造成弱陽性結果漏檢，但對抗-HIV 陽性結果檢測無影響；張桂芳等通過實驗證明抗凝劑對 HIV 陰性抗體檢測結果無影響，但是當抗凝劑高于 5mg/ml 時對 HIV陽性測定造成明顯負干擾，同時也影響血細胞分析，且同一抗凝劑同一濃度對不同公司的試劑檢測 HIV 抗體影響也不相同。

血液保存液是必須使用的，可以通過以下方法避免血液保存液帶來的不良后果：完善標本留樣確認程序，確保標本與血袋同源，采用試管標本代替血袋標本，避免從血袋導管采取復檢標本；采用新型留樣血袋，附帶留樣試管，將最初采集時未混入血液保存液的血液用于檢測；規范血液留樣操作，防止待檢標本混入血液保存液，若混入，可將抗-HIV 的臨界值相應調低。如果使用 EDTA-K2做抗凝劑，最好將濃度控制在1.5~2.5mg/ml 的范圍內，對于較難采集到足夠血液樣品的患者可采用血細胞分析檢測HIV 抗體。如采用抗凝血將做檢測樣本時最好與血清樣本進行對比試驗，并建議廠家對試劑的干擾能力進行嚴格的質量控制，說明適合使用的試劑及其相應濃度。

1.7 藥物

研究表明，高效價乙型肝炎免疫球蛋白可以和 HBsAg 形成免疫復合物，使HBsAg 陽性患者檢測呈陰性，出現兩對半少見模式；部分 HBsAg陰性者接種乙肝疫苗1~2 周后血清中可檢測到HBsAg，造成 HBsAg 一過性陽性，所以乙肝疫苗接種后一個月內最好避免做乙肝兩對半檢查。

1.8 細菌

一些細菌的菌體中可能含有內源性過氧化物酶會對使用相應酶做標記的測定方法產生影響，污染細菌可能含有內源性辣根過氧化物酶，使試劑出現非特異性顯色造成假陽性而干擾結果。

1.9 樣品因素小結

綜合得出，在正確的時間采集標本并防止污染、避免破壞，在干擾物處于一定濃度范圍內(膽紅素濃度≤344μmol/L，溶血血紅蛋白濃度≤4.95g/L，乳糜樣≤1460FTU)進行 ELISA 四種方法檢測均不影響檢測結果，但對競爭法檢測HBeAb 的影響有統計學意義。對于貧血性溶血、新生兒溶血性黃疸及抽血不當等造成的溶血標本盡量避免二次抽血對病人造成不必要的傷害。