大分子抗原因其具有兩個以上的抗原決定簇，而可用雙抗體夾心法測定，小分子半抗原如地高辛、茶堿等藥物以及T3，T4及睪酮等激素因其只有一個抗原決定簇，從而無法使用雙抗夾心方法測定，只能采用競爭抑制法測定。具體步驟如下：
1．先用抗小分子的特異抗體如雙抗體夾心法一樣包被固相并封閉。
2．同時加入待測樣本和酶標的小分子，溫育一定時間后洗板；此步中，待測樣本的小分子將與酶標小分子競爭與固相上特異抗體結合。
3．加入酶底物，溫育顯色測定，顯色的強弱與待測樣本中的小分子含量成反比(圖2—4)。
這種測定模式中，需要得到小分子與酶的結合物，而小分子酶結合物一則在制備上不如抗體酶結合物簡便，二則其純化亦頗為困難，結合有小分子的酶與游離酶之間難于分離。因此，有人嘗試在合成二或多聚體小分子的基礎上，建立雙抗夾心競爭ELISA方法測定小分子，測定的靈敏度和特異性均有所提高(圖2—5)。