凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術,可用于定性和定量分析。這一技術zui初用于研究DNA結合蛋白,目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同,可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白,可用純化蛋白,部分純化蛋白,或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時,依據目的RNA結合蛋白的位置,可用純化或部分純化的蛋白,也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特異),和其它非相關的片段(非特異),來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據復合物的特點和強度來確定特異結合。

重要試劑:
Boitin-N4-CTP (invitrogen # 15918-18)
TdT (NEB # M0252L)
Poly(dI.dC) (sigma #P4929)
Hybond-N 尼龍膜 (Amersham #RPN303B)
發光底物 (寧波 唯奧)
緩沖液:
Buffer A (store at 4℃)
Hepes (pH7.9) 10mM
KCl 10mM
EDTA 0.1mM
DTT(fresh added) 1mM
PMSF(fresh added) 0.5mM
Buffer B (store at 4℃)
0.5M EDTA in PBS (pH7.4)
Buffer C (store at 4℃)
Hepes (pH7.9) 20mM
NaCl 0.4M
EDTA 1mM
DTT(fresh added) 1mM
PMSF(fresh added) 1mM
Buffer I (store at RT)
Tris (pH7.5) 0.1M
NaCl 1M
MgCl2 2mM
Buffer II (pH7.5) (store at RT)
馬來酸 100mM
NaCl 150mM
Buffer III (store at RT)
Tris(pH9.5) 100mM
NaCl 100mM
MgCl2 50mM
Blocking Buffer (store at 4℃)
0.3%Tween-20, 0.3%Triton X-100, 5%BSA in Buffer I
Wash Buffer
0.3%Tween-20 in Buffer II
20×SSC (1L pH7.0)
NaCl 175.3g
檸檬酸鈉 88.2g
10×Binding Buffer (store at -20℃) [在公司(碧云天)購買:5×binding buffer,內含Poly(dI.dC)]
Tris (pH7.5) 0.1M
KCl 0.5M
DTT 10Mm
Poly(dI.dC) (store at -20℃)
1mg/ml in TE (pH7.5)
SA-HRP(儲存液store at -20℃ 工作液store at 4℃)
1mg/ml in 50%PBS (pH7.2) 50%Glycerin
5×TBE (5L)
EDTA 18.612g
硼酸 139.1175g
Tris 272.565g
5×TdT Reaction Buffer (store at -20℃) (pH7.2)
Sodium cacodylate 0.5M
CoCl2 10mM
TCEP 1mM
Biotin-N4-CTP (store at -20℃)
Biotin-N4-CTP 50mM
Tris (pH7.5) 10mM
EDTA 1mM