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  • 發布時間:2020-06-29 13:01 原文鏈接: EMSA凝膠遷移(一)

    實驗原理


    凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術,可用于定性和定量分析。這一技術zui初用于研究DNA結合蛋白,目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

    通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同,可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白,可用純化蛋白,部分純化蛋白,或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時,依據目的RNA結合蛋白的位置,可用純化或部分純化的蛋白,也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特異),和其它非相關的片段(非特異),來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據復合物的特點和強度來確定特異結合。 


    錨點

    實驗試劑


    重要試劑:

    Boitin-N4-CTP           (invitrogen    # 15918-18)

    TdT                          (NEB        # M0252L)

    Poly(dI.dC)               (sigma       #P4929)

    Hybond-N 尼龍膜       (Amersham   #RPN303B)

    發光底物                    (寧波    唯奧)

    緩沖液:

    Buffer A  (store at 4℃)

    Hepes  (pH7.9)                  10mM

    KCl                                    10mM

    EDTA                                0.1mM

    DTT(fresh added)                 1mM

    PMSF(fresh added)            0.5mM


    Buffer B (store at 4℃)

    0.5M EDTA in PBS (pH7.4)


    Buffer C  (store at 4℃)

    Hepes  (pH7.9)                 20mM

    NaCl                                  0.4M

    EDTA                                 1mM

    DTT(fresh added)                1mM

    PMSF(fresh added)              1mM


    Buffer I  (store at RT)

    Tris (pH7.5)             0.1M

    NaCl                           1M

    MgCl2                       2mM    


    Buffer II (pH7.5) (store at RT)

    馬來酸                     100mM

    NaCl                       150mM


    Buffer III  (store at RT)

    Tris(pH9.5)              100mM

    NaCl                        100mM

    MgCl2                        50mM


    Blocking Buffer (store at 4℃)

    0.3%Tween-20, 0.3%Triton X-100, 5%BSA in Buffer I


    Wash Buffer

    0.3%Tween-20 in Buffer II


    20×SSC (1L  pH7.0)

    NaCl                 175.3g

    檸檬酸鈉              88.2g

    10×Binding Buffer (store at -20℃) [在公司(碧云天)購買:5×binding buffer,內含Poly(dI.dC)]

    Tris (pH7.5)                  0.1M

    KCl                               0.5M

    DTT                            10Mm


    Poly(dI.dC) (store at -20℃)

    1mg/ml in  TE (pH7.5)


    SA-HRP(儲存液store at -20℃ 工作液store at 4℃)

    1mg/ml in  50%PBS (pH7.2) 50%Glycerin


    5×TBE  (5L)

    EDTA                         18.612g

    硼酸                       139.1175g

    Tris                         272.565g

      

    5×TdT Reaction Buffer (store at -20℃) (pH7.2)

    Sodium cacodylate              0.5M

    CoCl2                               10mM        

    TCEP                                  1mM


    Biotin-N4-CTP (store at -20℃)

    Biotin-N4-CTP               50mM

    Tris (pH7.5)                  10mM            

    EDTA                              1mM



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  • 调性视频