ETD：將成為蛋白質組學研究的標準方法

——訪賽默飛ETD技術發明人John E.P. Syka 博士

　　【導語】質譜已經成為開展蛋白質組學研究的基礎平臺，更確切地說，具有MS/MS功能的質譜已成為蛋白質組學研究的基礎平臺。過去，CID/CAD技術是實現MS/MS功能的唯一手段，在蛋白質鑒定的自下而上（Bottom-up）時代起到了關鍵的作用。隨著研究的深入開展，科學家們面臨著蛋白質的翻譯后修飾鑒定、自頂而下（Top-down）的完整蛋白質裂解研究等一系列新的挑戰，ECD和ETD技術的出現，在應對這些研究挑戰中展示出誘人的前景，因此從2003年開始，研究者們每年召開一屆烏普薩拉電子捕獲（ECD）與電子轉移裂解（ETD）國際會議來全球交流并分享成果。在第十屆會議于北京召開時，我們有幸采訪到賽默飛ETD技術發明人John E.P.Syka博士，他將為我們描述自己的發明歷程，并為我們展示ETD技術應用的前景……

John E.P.Syka博士

Syka：發明ETD 絕不是偶然

　　Syka首先就表明他不是公司的市場人員，我們在訪談中的確感受到了研發人員的談話風格，在每一個問題上Syka都談得過于具體，包括他如何畢業、如何騎著自行車到賽默飛面試、自己的家庭、自己的每一次項目是如何開始的、中間遇到了什么樣的問題、具體是怎么解決的，等等等等。每當我們問到中間的某一個產品、某一項技術的問題，Syka就會展開詳細地描述。乍一聽，覺得很boring，但仔細一想，真正牛×的公司研發人員可能真的是這樣的。正是在這些非常細節的、一絲不茍的作風中，誕生出了真正偉大的、影響全世界人民的創新產品。

　　我們把Syka的經歷簡單概括一下，可以理清一個脈絡。

　　Syka于1977年畢業于斯坦福大學，應聘到位于San Jose的Finnigan（現在是賽默飛的色譜質譜部）公司做電子學工程師。隨后，他在George C. Stafford的項目組，和團隊一起設計出第一臺商品化的離子阱質譜ITD（1983年）。此后又參與了賽默飛幾乎所有的質譜相關研發和商品化項目，比如四極桿、三重四極桿、AGC（用于離子阱的自動增益控制）、離子阱、Orbitrap質譜等等。在設計開發ITD離子阱質譜后，Syka到Don Hunt實驗室、Graham Cooks等大學的實驗室，和學術界著名的質譜科學家一起合作，開發新的技術，并把技術變成了最終的產品。可以說，Syka和賽默飛推出的幾乎每一款質譜，從前期的設想到后來的產品，都有著密不可分的關系。

　　比如在1983年推出商用離子阱質譜后，Syka就提出設計一種“ICR-like”的更好的離子阱的設想，并因此去Don Hunt的實驗室深入研究FTICR-MS、線性離子阱的技術，Don Hunt后來發明了從ICR池中彈射（ejection）離子的技術，最終變成了2003年賽默飛推出的商品化LTQ，雖然，LTQ的第一發明人是Jae C. Schwartz。我們也很容易地發現，LTQ的線性離子阱分析器，和FTICR-MS的離子回旋共振池（ICR）模樣的確很相似。這以后，Syka和同事們仍舊持續研究，進一步改進離子阱，努力讓其可以達到像FTICR-MS那樣的鏡像電流檢測，并獲得接近FTICR-MS的性能。他們曾嘗試過各種方式，如設計：FT-Ion Trap，Linear FT Ion Trap，Hybrid Magnetic FT Ion trap等。

　　當Syka和其同事見到了位于曼徹斯特的Alexander Makarov后，他們一起做了一個重大的決定，提議賽默飛購買Alexander 所屬的HD technolies公司，支持其攻克最后的難關，并于2005年推出了劃時代的Orbitrap。

　　Syka由于其最早的設計“ICR-like”離子阱的設想，在LTQ和Orbitrap項目上，都當了好的“伯樂”；而在ETD方面，他成為真正的被世人記住的發明人。Syka同我們分享了從2002年底開始、到2004年發明ETDZL，2005年推出用于LTQ上的ETD的歷程，他們用一臺賽默飛1981年產的MAT 4500 GC-MS的負化學源來做實驗，其間克服了真空、靈敏度等一系列問題，最終的結果，使他的發明獲得了PITTCON? 2007編輯推薦銀獎。2008年，ETD技術用在了LTQ Orbitrap上，讓科學家們更為振奮。著名蛋白質組學研究專家Steven P. Gygi博士表示：“在LTQ Orbitrap中引入ETD技術在蛋白質組學中將是個里程碑事件，ETD將是下一代蛋白質組學的主流和前沿技術，它的應用將如此廣泛，以致于我難以想象今后研究或核心質譜實驗室中有不用到該新技術的系統。”

　　所以，Syka發明ETD，絕不是偶然！

賽默飛色譜質譜部市場經理王勇為博士（左）與John E.P.Syka博士（右)

為什么要使用ETD技術？

　　在當前的蛋白質鑒定中，CID（CAD）碰撞誘導解離是最常用的肽段碎裂技術，CID 常應用于采用胰蛋白酶（trypsin）酶切、在質譜儀中離子化的肽段。肽碎裂過程主要產生 b 和 y 類型的離子。CID（CAD）技術的優點是：可產生豐富的子離子，已被廣泛使用了幾十年。其缺點是：（1）雖然可觀測到由于翻譯后修飾（PTM）產生的中性丟失現象，但不容易保留PTM翻譯后修飾的基團特點。（2）序列離子的相對豐度存在較大的變化。（2）對于非胰蛋白酶酶切的較長肽段，高堿性肽、天然蛋白，產生的序列離子較少，使得鑒定結果的可靠性顯著降低。

肽鏈碎裂點示意圖

　　1998 年，McLafferty 等發現了蛋白質電子捕獲碎裂（electron capture dissociation, ECD）的現象，進而應用到蛋白質鑒定領域。與 CID 基于碰撞能量再分配的基本機理不同，ECD 一般是通過低能量的自由電子與質子化的多電荷蛋白質或肽離子，在相互作用的過程中由于放熱而瞬間產生碎裂，它是一個非各態歷經（nonergodic）的過程，主要產生由 N—Cα鍵的斷裂而形成的 c 和 z 類型離子。

　　ECD的優點為：（1）碎裂機理不同于CID，不受限于肽的長度、序列，（2）保留了PTM，（3）對于非胰蛋白酶酶切的較長肽段，高堿性肽、蛋白離子，可產生豐富的序列離子。但使用ECD有很大的限制：由于要同時容納多電荷蛋白質或肽離子與自由電子在離子阱質譜儀中技術上所面臨的困難，ECD只能用于昂貴且運行維護成本極高的FTICR-MS上，ECD 在蛋白質組學中的應用受到了儀器方面的限制，并沒有獲得廣泛的開展。

ECD機理，文獻：J. Am Chem. Soc. 1998, 120, 3265-3266, Roman A. Zubarev； Neil L. Kelleher, 和Fred W. McLafferty

ETD機理，US2005199804 (A1) ：Electron transfer dissociation for biopolymer sequence analysis

　　Hunt和Syka等于 2004 年發現，通過攜帶一個電子的陰離子（anion）與肽陽離子（cation）相互作用，也可以產生類似 ECD 的碎裂行為，他們稱之為“電子轉移解離”（electron transfer dissociation, ETD），進而，他們通過改進已有的LTQ線性離子阱質譜儀，在LTQ的后端添加通過化學離子化（CI）的方法引入攜帶電子的陰離子，然后與肽陽離子在離子阱中相互作用而產生碎裂，發明了一套完整的 ETD 技術。ETD技術具有上述ECD技術的所有優點，ETD獲得MS/MS的時間只需100 ~ 300 毫秒，比ECD更容易滿足蛋白質組學高通量測定的要求，同時線性離子阱質譜儀維護簡便、購買花費低、已被廣泛接受，因此ETD技術被迅速推廣到眾多實驗室，Syka表示，全球已有數百臺賽默飛的LTQ或LTQ Orbitrap質譜安裝了ETD。

安裝在LTQ上的ETD，肽/蛋白正離子從LTQ前端透鏡進入，被Trap后送入LTQ的前端四極桿區（Front Section），用一臺氣質聯用的負化學源產生負離子，從LTQ的后端送入，穩定后，送入LTQ的后端四極桿區（Back Section），然后將正離子和負離子一同送入LTQ的中心四極桿區（Center Section）進入離子/離子反應，生成的c、z離子送出LTQ在Detector1和Detector2雙檢測器中檢測。

安裝在LTQ Orbitrap上的ETD

ETD的典型應用

　　1、翻譯后修飾和二硫鍵分析

PNAS | February 13, 2007 | vol. 104 |no. 7 | 2193-2198，Analysis of phosphorylation sites on proteins from Saccharomyces cerevisiae by electron transfer dissociation(ETD) mass spectrometry，使用LTQ XL，上圖是CAD的MS/MS譜，只能顯示磷酸化肽中性丟失后的離子，而對應的ETD譜，可以顯示豐富的序列、磷酸化的位點，保留的磷酸化肽等信息。

　　前文已述，CID/CAD對于常見的翻譯后修飾（PTMs）等容易形成中性丟失，ETD在測定磷酸化修飾等翻譯后修飾方面具有顯著優點，ETD主要斷裂主鏈，可以得到豐富的c、z序列離子，而且保留修飾的基團，如磷酸化修飾、N-和O-糖基化修飾、磺化修飾等。

　　另外，ETD還被證明可以引起二硫鍵斷裂，獲得蛋白質二硫鍵的豐富信息。

　　2、高堿性蛋白/肽：如組蛋白Histone

　　對于高堿性的蛋白/肽，CID/CAD也很難得到豐富的序列離子，而ETD非常擅長，這對組蛋白（Histone）的研究非常有用。而組蛋白對于研究基因調控、新藥開發非常重要。應用ETD技術研究組蛋白，已發表在Science這樣的重要期刊上。

用ETD研究組蛋白Histones: Science 318, 444(2007) , 研究去甲基化Demethylated 和氧化Oxidized的H4

　　3、更適用于Top-down流程

用ETD/PTR技術分析了Hela 細胞中得到的組蛋白 H3. 1 和Chicken 紅細胞中的H2A. Z 的蛋白N端和C 端的15～40 個氨基酸序列。PNAS, July 5, 2005, Vol. 102, No.27, 9463-9468, Protein identification using sequential ion/ion reactions and tandem mass spectrometry

　　蛋白質組學近年來興起的Top-down方法，在用CID/CAD時遇到較大的困難，因為CID/CAD對于帶3個以下電荷的肽段斷裂較好，不太適用于帶高電荷的更大的蛋白。而ETD 能夠很好地裂解帶有更高電荷的大片段肽段和完整蛋白，得到幾乎完全斷裂的肽段。隨著譜圖解析技術的增強，以及在ETD基礎上發展的PTR技術質子轉移電荷還原反應（proton transfer/ charge reduction , PTR) ，ETD將在完整蛋白的Top-down、de novo測序方面發揮更大的作用。

　　此外，在蛋白質組學具體體系的研究中，CID/ETD二者的有機結合可以顯著提高蛋白質鑒定的序列覆蓋度。CID 適合使用胰蛋白酶（trypsin）酶切的肽段，這樣的肽段一般僅在兩端帶有堿性基因(N 端的自由氨基和 C 端賴氨酸或精氨酸的堿性側鏈基因)；而ECD/ETD 更適合用 Lys-C 等產生堿性氨基酸較多的酶來酶切蛋白質，生成的肽段碎裂質量較高。

ETD將成為蛋白質組學研究中的標配

　　正是因為ETD在翻譯后修飾、二硫鍵測定、Top-down技術、組蛋白分析等方面的應用前景，賽默飛已售出了數百套ETD。對ETD技術的應用前景，Syka博士表示：

　　（1）ETD技術還需要更多地推廣，并培訓研究者們更好地使用。畢竟，CID技術應用出現了幾十年，研究者們無論怎么用，總是可以得到一些結果，不會產生有預想非常大的差距。但對于ETD技術，研究者們首先要有一個了解和認識，才能用好它。

　　（2）ETD將成為蛋白質組學研究的標配。相比第一臺，最新的ETD質譜在設計上已經做了很多改進，性能、軟件各方面已經提高很多。但是仍然不能像CID那樣，隨便調置一下設置就可以得到結果。這也是今后ETD發展的一個方向，需把它做成一種標準流程化的方法，無論怎么使用都可以得到有用的信息。

　　（3）ETD和CID是一種互補的技術。目前，CID使用得最多，是最常用的一個方式，但像組蛋白、Top-down分析、翻譯后修飾定量等，用ETD更合適。

　　最后，Syka博士說：“假如想看得更遠，做得更加深入，就要考慮使用ETD技術。”

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　　附：賽默飛領先的ETD產品

　　在ETD技術發明后的第二年(2005年)，賽默飛就首先推出了帶有ETD功能的LTQ型質譜儀, 2007年又推出了改良型的LTQ XL質譜儀，2008年繼續推出可同時支持高分辨率和低分辨率測量ETD碎片質量的LTQ Orbitrap XL 質譜儀，它已是目前市場上最高端的具有ETD功能的質譜儀。

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　　LTQ Orbitrap XL增加了高靈敏度翻譯后修飾分析能力。ETD與LTQ Orbitrap XL聯用組成了最先進的蛋白質組學平臺, 可以提供三個互補性解離技術，用于蛋白/多肽表征，翻譯后修飾(PTM)分析 (尤其是磷酸化)，及Top-down或Middle-down的蛋白和多肽序列分析。

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