（2）紅細胞被溶解后再對白細胞染色：此方法的優點是可以了解被染白細胞的數量以及存活率。但由于有時有些標本比較敏感，溶解紅細胞后，還要經過多個染色步驟，這樣容易造成抗原的喪失。此法具體步驟如下：
①室溫下放入14ml氯化銨在15ml的試管里。
②加入0.5～1ml全血，混合3～5min。
③立即離心100～150×g，并用PBS洗2次。
④白細胞計數，注意存活率應在90%以上。做成每毫升含5×10 6 白細胞懸浮液。將細胞分配到5ml的試管，每試管0.2ml，即1×10 6 個細胞。
⑤熒光標記的單克隆抗體染色30min，4 ℃ ，避光。抗體濃度配制如前所述。
⑥PBS洗3次后，用0.5%甲醛固定。方法如前。
（3）用Ficoll—Hypaque 梯度離心法分離出單個核細胞：用此法可以分離骨髓細胞、淋巴結、扁桃體搗碎后的單細胞懸液等。血液標本應有抗凝劑。取血到分離不能超過6h。
①抗凝全血4～20ml，用等量PBS或Hanks液稀釋。
②稀釋血8或40ml置于15或50ml離心管內，4或10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分離液，比重為1.007）從離心管底部輕輕加入到血的下面。這種方法對血的擾動較小，比將全血加到Ficoll上面為好。加完后，可以清楚看到Ficoll與全血之間有一明顯的分界線。注意在Ficoll快加完時應特別小心，否則有可能加入氣泡攪混血樣，使血與分離液混合，達不到分離的目的。
③離心350～400g,30min。紅細胞、粒細胞以及死細胞將位于離心管底部，中間層的單個核細胞為淋巴細胞、單核細胞和一些血小板。
④取出中間層中所有細胞，若在Ficoll中還有細胞也要取出，這也是單個核細胞（PBMC）。
⑤用PBS洗3次，第1次清洗時，可用較快速400×g離心10min。因為有可能中間層中混有一些ficoll，比重增加而細胞不易沉降。
⑥PBMC計數，注意存活率應高于90%。配成5×10 6 個/ml的細胞懸浮液。
⑦取出0.2ml的懸浮液加入到5ml試管（內含1×10 6 細胞），用熒光標記的單克隆抗體染色，方法如前。洗3次后固定。注意必須先染色后固定，固定后的細胞膜通透性改變，會導致熒光標記的抗體進入細胞中去，而在顯微鏡下觀察的染色效果則和死細胞一樣。當用FCM分析時，則均為陽性而達不到檢驗目的。這也是用FCM分析的細胞存活率應高于90%的原因。
（4）熒光標記抗體的細胞染色：如前所述，FCM分析被熒光標記的抗體染色的細胞，在選擇熒光染料時必須注意這些熒光染料所需要的激發光波長是否與所使用的FCM的激發光譜相匹配。一般各個公司所采用的綠色熒光染料為FITC，而選用的紅色熒光染料卻不盡相同，有的用TRITC，有的用藻紅蛋白（PE），所需要的激發光譜就不一樣，因而若因匹配不當則會招致熒光抗體所染的細胞分析不出來，這是應該注意的。
這里的標本染色方法和免疫熒光法相同。下面僅說明一些具體的注意事項：
①在用間接法染色時，染色步驟依次為第一抗體→清洗→第二抗體→清洗→紅細胞溶解。為了實驗的方便，將第二抗體也配成每次實驗用10μl。
②雙色法：雙色法多用于直接染色法。將分別用FITC和PE標記的抗體各10μl置入同一個含有約1×10 6 /0.2ml的試管內，30min，4℃避光。然后清洗、固定。
目前不少制備單克隆抗體的公司已將比值有意義的兩種抗體，分別用紅、綠熒光染料標記后，制成一種試劑。如CD 2 —FITC/CD 20 —PE；CD 4 -FITC/CD 8 -PE等。可按說明使用，具體用量為每次實驗10μl。
③對照組：眾所周知，免疫組化的染色過程中，陰性和陽性對照是必不可少的。在準備用FCM分析的細胞時，對照標本的制備顯得格外重要。因為一次用FCM分析的樣品可能會很多，甚至多達上百個試管。對同一病人也可能會用到20～30個不同的單克隆抗體。每一個病人都要有相應的陰性對照。陰性對照主要用于儀器分析細胞之前，設立陰性和陽性的分界線。陽性對照主要用于檢查染色方法。陽性對照細胞選自那些已知的細胞和已知的單克隆抗體中的陽性反應最明顯者。陰性對照細胞有以下幾種：
1）非染色細胞：直接染色法時，用10μl PBS代替與熒光結合的單克隆抗體，其它步驟相同。間接染色法時，分別用10μl的PBS代替第一抗體和熒光第二抗體，其它步驟相同。
2）使用非特異性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg），代替特異性的單克隆抗體。這是由于所使用的單克隆抗體來自小鼠，可能造成非特異性的假性反應，因此使用MsIg作為對照。同時還需要注意選擇與實驗用單克隆抗體亞類一致的MsIg。如大部分單克隆抗體為IgG1，也有部分抗體為IgM，所以用MsIg作對照組時，往往使用MsIgG和MsIgM兩種。直接染色法時，用10μl與熒光結合的MsIg，代替熒光單克隆抗體。間接染色時，用10μl無熒光的MsIg代替第一抗體。其它步驟與實驗組相同。
3）雙染色對照：將各10μl 的分別與紅熒光染料和綠熒光染料結合的MsIgg 或MsIgM，加入到同一個試管，代替熒光的特異性單克隆抗體，其它步驟相同。
4）間接法對照：用10μl的PBS代替第一抗體。熒光第二抗體的濃度和使用量均與其它實驗相同，其它實驗步驟也和實驗組相同。
二、白細胞免疫熒光分析的數據分析
在儀器調試和校準及標本制備完畢之后，就要做測試和數據分析工作。這里先討論一下有關數據測量和分析的技術問題，而一些醫學應用的具體參數的測量和分析后面做介紹。
1.0 。 散射和90 。 散射的雙指標的二維圖像分析 可以把0 。 和90 。 散射分別選作二維圖像的X軸和Y軸指標。通過圖中數據點分布把全血分為淋巴細胞、單核細胞和粒細胞幾個亞群（圖10-9）。
圖中， A 、 B 圖的淋巴細胞數大約有 6000 ～ 9000 個； C 、 D 圖約有 2000 ～ 4000 個。分群編號依次表示： ① 紅細胞、死細胞和渣滓； ② 淋巴細胞群； ③ 大顆粒淋巴細胞； ④ 單核細胞； ⑤ 粒細胞。數據是對 1000 個細胞分析得到的。