FQPCR技術簡述

FQ-PCR技術是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針來實現其定量功能的，與變通PCR相比，FQ-PCR具有許多優點。其特點、原理和方法以及應用簡述如下。

1 原理和方法
FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反應系統中加入一個熒光標記探針。該探針可與引物包含序列內的DNA模板發生特異性雜交，探針的5’端標以熒光發射基因FAM（6-羧基熒光素，熒光發射峰值在518nm處），靠近3’端標以熒光淬滅基團TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，熒光發射峰值在582nm處），探針的3’開端被磷酸化以防止探針在PCR擴增過程中被延伸。當探針保持完整時，淬滅基團抑制發射基團的熒光發射。發射基團一旦與淬滅基團發生分離，抑制作用被解除，518nm處的光密度增加而被熒光探測系統檢測到。復性期探針與模板DNA發生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿DNA模板移動，當移動到探針切斷，淬滅作用被解除，熒光信號釋放出來，模板每復制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是一對一的關系，因此用該技術可對模板進行準確定量。實驗儀器一般使用PE公司研制的ABI7100型 PCR擴增儀，也可用其它PCR儀。如果用ABI7700型反應型反應系統進行實驗，反應結束后，通過電腦分析，可直接給出定量結果。如果用其他PCR儀，則需要同時使用熒光探測儀測量反應管中的熒光信號，計算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表樣品管熒光發射基團發光強度與淬滅基團發光強度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR過程中熒光信號變化量，經過數據處理，即可得出定量結果。由于熒光探針的引入，顯著提高了實驗的特異性。

       探針設計一般應符合以下條件：①探針長度應在20～40個堿基左右，以保證結合的特異性。②GC堿基含量在40%～60%，避免單核苷酸序列的重復。③避免與引物發生雜交或重疊。④探針與模板結合的穩定程度要大于引物與模板結合的穩定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實驗結果有影響。

2 特點
      FQ-PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針的應用，可以通過光電傳導系統直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性，克服了常規PCR的許多缺點。如一般PCR產物都需通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色紫外光觀察結果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測，不僅需要多種儀器，而且費時費力，所使用的染色劑溴化乙錠對人體又有害，這些繁雜的實驗過程又給污染和假陽性提供了機會。而FQ-PCR只須在加樣時打開一次蓋子，其后的過程完全是閉管操作，不需要PCR后處理，避免了常規PCR操作中的諸多弊端。

        實驗一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR擴增儀。該儀器具有以下特點：①應用廣泛：可用于DNA和RNA的PCR產物定量、基因表達研究、病原體檢測及PCR條件的優化等。②獨特的定量原理：采用熒光標記探針，經激光激發后熒光量隨PCR循環而累積，從而達到定量目的。③工作效率高：內置9600型PCR擴增儀，電腦控制1～2小時全自動同步完成96個樣品的擴增及定量。④無須凝膠電泳：無須對樣品進行稀釋和電泳，只須通過特殊探頭在反應管內直接檢測。⑤無管道內污染：采用獨特全封閉反應管及光電傳導系統，無須顧及污染。⑥結果重現性好：定量動態范圍高達五個數量級。

所以自從此項技術研制成功以來，受到許多科研工作者的重視并在多個領域得到應用。