實驗概要
本實驗介紹了三種抗體純化的方法。
實驗步驟
1. 抗Fab片段抗體親和層析純化法
1) 偶聯抗人或抗鼠Fab片段抗體到Protein G Sepharose，將純化的抗人或鼠Fab片段抗體以2mg/ml的比例與Protein G Sepharose凝膠珠溶液混合，室溫旋轉孵育1h。用10倍量的0.2mol/L硼酸鈉(pH值9.0)洗兩次，4 000r/min離心5min，用10倍量的0.2mol/L pH值9.0硼酸鈉溶液，重懸凝膠珠子，加入足夠量的DMP(dimethylpimelimide，Sigma公司)至終濃度為20mmol/L左右，室溫旋轉混合孵育30min后，離心去上清，加入0.2mol/L乙醇胺終止反應。繼續在乙醇胺溶液中封閉2h，用PBS清洗數次，用PBS懸起來后制備2ml親和凝膠柱。
2) 100ml IPTG誘導表達的Fab片段菌液，4℃ 4 000r/min離心15min。用pH值7.2的PBS 10ml懸起沉淀物，反復凍融三次，12 000r/min 4℃離心20min，取上清，過0.45μm濾膜，收集濾過溶液。
3) 用50mmol/L pH值7.0 PBS結合緩沖液平衡上述親和層析柱。
4) 加入步驟2中濾過的Fab片段抗體粗制品于柱中，反復循環30min至1h。
5) 加5~10ml 10mmol/L pH值6.8的PBS預洗緩沖液，洗去非特異性吸附蛋白。
6) 加入8ml 100mmol/L pH值2.7的甘氨酸鹽酸緩沖液洗脫結合的Fab片段蛋白，每管收集1ml。
7) 于收集管中加入50~80μl 1mol/L pH值9.0的TrisHCl緩沖液中和洗脫下來的溶液，置于4℃待測定蛋白含量。
8) 將含有蛋白高峰管合并，加入Amicon濃縮柱，根據商家手冊離心濃縮。
9) 對純化濃縮后的Fab片段蛋白10~20μg進行SDSPAGE電泳，用12.5%聚丙酰胺凝膠，常規SDSPAGE電泳條件。對于鼠Fab片段抗體，由于輕鏈和重鏈分子量類似，故在25kD左右獲一條帶。對于人Fab片段抗體，如果λ鏈和Fd鏈的組合，可能獲兩條鏈，25kD左右的為Fd鏈，28kD左右的為λ鏈。
2. Protein ASepharose柱層析純化法Protein ASepharose可用于純化來源于VH3免疫球蛋白家族的重組抗體。
1) 用PBS浸泡Protein ASepharose。
2) 用50ml PBS將Protein ASepharose裝成2ml柱子。
3) 將制備好的抗體溶液上樣。
4) 用下列5倍體積量的溶液依次洗柱子：PBS、PBS0.5mol/L NaCl、0.2mol/L甘氨酸(pH值6.0)、0.2mol/L甘氨酸(pH值5.0)。
5) 用3倍柱床體積的0.2mol/L甘氨酸(pH值3.0)洗脫液洗脫，每管收集1ml，加200ml 1mol/L TrisHCl(pH值7.4)中和。
6) 將洗脫下來的抗體對PBS透析過夜。
3. 金屬離子親和層析柱純化法此方法可用于帶有6個組氨酸的重組抗體。
1) 抗體溶液制備，如從上清中收獲抗體片斷，10 000r/min離心15min，用PEG濃縮或用超濾膜濃縮(SterivexHV 0.45μm，Minipore公司，美國)。如從膜間隙收獲抗體片斷，則將菌液10 000r/min離心15min，用原菌量1/20體積的TE葡萄糖緩沖液(30mmol/L Tris pH值7.0，20%葡萄糖，1mmol EDTA)重懸沉淀，置冰浴20min，12 000r/min離心15min，重懸沉淀于1/20量的5mmol MgSO４中，冰浴20min，12 000r/min離心15min。
2) 將抗體溶液對上樣緩沖液(50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值7.5，500mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑)以4mol/L濃度透析過夜。
3) 用5ml NiNTA懸液(Qiagen，德國)填充層析柱。
4) 用50ml上樣緩沖液平衡柱子。
5) 將抗體溶液加入柱中。
6) 用清洗緩沖液(50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值7.5，500mmol/L NaCl，3.5mmol/L咪唑)洗去非特異性吸附蛋白。
7) 用洗脫液(50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值7.5，500mmol/L NaCl，100mmol/L咪唑)洗脫，每管收集1ml組分，共4~10ml。
8) 將抗體組分對PBS透析以去除咪唑和高濃度氯化鈉。
9) 用復原緩沖液(50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值7.5，500mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑)清洗柱子后，用上樣緩沖液(50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值7.5，500mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑)平衡柱子。
4. Fab抗體的特異性鑒定
對于所獲的Fab片段抗體，對某種特異性抗原的特異性鑒定，根據其所針對的抗原不同，則采用的方法也不同。主要方法有：
1) Fab片段抗體對同位素S３５標記抗原的特異性放射免疫沉淀，適用于構象依賴或非構象依賴的抗原。在此試驗中，所用Sepharose 4B珠子需偶聯相應的抗人或抗鼠Fab抗體，除了特異性的蛋白帶外，結果通常還會出現一條70kD左右的非特異性條帶。
2) 對特異性抗原的Westernblot鑒定，適用于一些非構象依賴的線性抗原。