G.靈芝原生質體的制備與再生

實驗概要

G.靈芝原生質體的制備與再生，對G.靈芝原生質體單核化十分重要。本實驗主要介紹G.靈芝原生質體的制備與再生方法。

靈芝有兩種不同類型的菌絲（單倍體菌絲和二倍體菌絲）。利用原生質體再生的方法可以分離成一個單細胞，也許只含一套染色體。首先，我們把菌絲體消化成單個原生質體。然后，稀釋成適當濃度的原生質體懸浮液。第三，在MYG介質中再生原生質體。

主要試劑

溶壁酶

甘露醇的PDB肉湯

MYG瓊脂培養基

主要設備

搖床

培養箱

實驗步驟

1. 將菌絲體接種到含100 mL的PDB介質的容積250 mL瓶中（200g土豆，20g葡萄糖，1L水）。

2. 恒溫28°C避光培養菌絲體，保持培養箱以50轉/分的轉速持續搖動。

3. 將培養物無菌紗布過濾滅菌。

4. 取大約5g菌絲體放于容積為50 mL 的試管中，試管中含20 mL已過濾滅菌的1.5％溶壁酶和0.6 M甘露醇（廣東省微生物研究所，中國）。

5. 然后30℃孵育2h，期間不時攪拌。

6. 2 h后取出菌絲片段，放于MYG瓊脂培養基中（2％麥芽提取物，0.2％酵母提取物，2％葡萄糖，1.5％瓊脂），用于靈芝原生質體再生。

7. 稀釋原生質體懸浮至濃度為1×10 ⁴細胞/毫升，取50μL稀釋后的原生質體懸浮液接種于MYG培養基中，25°C，避光培養。