[實驗原理]
免疫印跡（Western blotting 或
Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學檢測三個部分組成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質轉移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉移的方法多用電泳轉移（轉移電泳），它又有半干法和濕法之分。第三步是用特異性的抗體檢測出已經印跡在膜上的所要研究的相應抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的。現在多用間接免疫酶標的方法，在用特異性的第一抗體染色后，再用酶標的第二抗體（堿性磷酸酶（Ap）或辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗第一抗體的抗體）染色，再加酶的底物顯色，通過膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來顯示抗原的存在。
為了使初學者能夠在實驗過程中觀察到所要檢測的目的蛋白，本實驗使用的是非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳，以保持GFP的天然活性，利用熒光對其進行追蹤。此外，實驗中用國產的HRP標記的蛋白A取代第二抗體，以節省費用。蛋白A是從細菌分離的一種能識別多種動物IgG的蛋白，在許多場合它都可以作為第二抗體的替代物。同樣是為了節省費用，實驗中用醋酸纖維素膜（AC膜）代替硝酸纖維素膜（NC膜），這樣要便宜得多，而效果卻無大差別。
第一部分：GFP抽提物在非變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳
非變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳，除試劑中不含SDS及蛋白樣品不加熱處理外，其余的與SDS-PAGE幾乎相同。因為要做免疫印跡，電泳結束后，凝膠不染色，而是做轉移電泳。
[儀器、材料和試劑]
(一)儀器與器材
1．垂直板電泳槽及配套的玻璃板，梳子
2．電泳儀
3．微波爐
4．小型高速離心機
5．專用紫光燈（BIO-RAD公司）
6．槍，槍頭，1.5mL 離心管
(二)材料
1．蛋白樣品：GFP粗提物的飽和硫酸銨沉淀
(三)試劑
1．1.5mo1／L Tris?HCl pH 8.8
2．0.5mo1／L Tris?HCl pH 6.8
3．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用雙蒸水定容至100mL，過濾備用，4℃存放。
4．10％Ap (-20℃存放)
5．2x 非變性膠樣品緩沖液：
0.125 mo1／L Tris?HCl pH6.8
20％ 甘油
0.01％ 溴酚藍
6．5x電極緩沖液
Tris 7.5g
G1y 36 g
雙蒸水溶解，定容至500mL，使用時稀釋5倍使用
[實驗操作]
1．裝配做膠用的玻璃板"三明治"：
2．做膠：先配制濃度為12％的分離膠，配方如下：
雙蒸水 3.3 mL
1.5mo1／L Tris?HCl (pH 8.8) 2.5 mL
Acr／Big(30％) 4.0 mL
TEMED 10 μL
10％AP 100 μL
總體積 10 mL （剛好灌制兩塊膠）
灌分離膠膠后在膠面上加水封，等膠自然凝聚后（此時在膠面與水封之間可見清晰的界限），開始配制4％的濃縮膠，配方如下：
雙蒸水 1.8 mL
0.5mo1／L Tris?HCl pH 6.8 0.75mL
Acr／Bis (30％) 0.4 mL
TEMED 5μL
10％Ap 30μL
總體積 3.0 mL （夠做兩塊板的濃縮膠）
灌濃縮膠、插1mm的梳子。待濃縮膠凝固后，小心地拔出梳子。如果拔出梳子后加樣孔之間的間隔發生扭曲，用注射器的針頭小心加以整理。
3．非變性凝膠電泳蛋白樣品的制作：在GFP粗提物的飽和硫酸銨沉淀中加2x 非變性膠樣品緩沖液100微升，用槍頭吹打，使沉淀溶解，將樣品液轉移到1.5mL離心管中，12000r/m離心3分鐘，取上清液加樣。
4．瓊脂封底：做好膠后，把玻璃板"三明治"從架子中取出，將兩玻璃板之間的硅膠夾條去掉，用2%融化的瓊脂填滿膠底的空隙，注意不要產生氣泡。
5．電泳槽組裝：封底后將玻璃板"三明治"凹玻璃面向內重新裝到"提籃架子"上，固定好后，將整個部件放到電泳槽的外殼中，然后加電極緩沖液。
6．加樣：取蛋白溶液離心后的上清液加樣，加成一個梯度，即每一泳道的加樣量依次減半。
7．電泳：先將電壓調到80V，當樣品進入分離膠后，調節電壓使恒定在150V。當溴酚藍移動到離底部約0.5cm時，關掉電源，停止電泳。
8．將玻璃板從電泳槽中取出，小心地用舊的電話卡撬開兩玻璃板，小心地用塑料牙簽將凝膠從玻璃上剝離下來，使凝膠貼在事先準備好的一張比膠面略大的濾紙上。操作時要徐緩，小心不要把膠弄破