實驗材料 進行轉染的細胞株按第二階段所介紹的方法制備表達了蛋白質探針的細胞
試劑、試劑盒 N-二羥乙基甘氨酸消化緩沖液NN-二甲基甲酰胺磷酸鈉磷酸鹽緩沖溶液TE木瓜蛋白酶Cy3 和 Cy5 OSu 單功能硫代吲哚花菁琥珀酰亞胺酯抗體SDS-聚丙烯酰胺凝膠明膠溶液聚-L-賴氨酸質粒 DNAGFP 融合載體CO2-非依賴性成像培養基
儀器、耗材 Centricon 濃縮器色譜柱蛋白 A-瓊脂糖凝膠柱可見吸收分光光度計組織培養板玻璃底組織培養皿放大器氬激光寬帶絕緣反射鏡MCPCCDGFPCy3單面鍍銀反射鏡曲鏡座透鏡支架標竿后支架倒置顯微鏡可變光圈透鏡水銀燈油接物鏡光學操作臺Power PC水循環冷卻裝置
實驗步驟
第一階段 用熒光染料標記蛋白質
材料
緩沖液和溶液
將儲備溶液稀釋到適當的濃度。
用 NaOH 調節的 N-二羥乙基甘氨酸（0.1mol/L,PH7.5)
用 NaOH 調節的 N-二羥乙基甘氨酸（1mol/L,pH9.0~9.5)
消化緩沖液
20 mmol/L 磷酸鈉
10 mmol/LEDTA
20 mmol/L 半胱氨酸/HCl 緩沖液（pH7.0)
N,N-二甲基甲酰胺（DMF)
在存儲容器中加入約 1/3 體積的吸濕性樹脂用于干燥 DMF。例如，可以始終將 AG501-X8 混合床樹脂 (Bio-Rad) 放在 DMF 原料瓶中。如果對 DMF 的完整性有任何疑問時，則可以另外加入一些新鮮樹脂，或者用新鮮樹脂替換老樹脂。這樣的操作是考慮到會出現標記蛋白質能否達到期望比例的問題，因為標記反應時水的存在（可能來源于 DMF) 會競爭游離染料。
含有 10 mmol/LEDTA(pH7.0) 的磷酸鈉（20 mmol/L)
磷酸鹽緩沖溶液（PBS)
TE(pH7.0)
酶和緩沖液
固定在瓊脂糖顆粒上的木瓜蛋白酶（分散在消化緩沖液中的 50% 混懸液；Sigma)
標記化合物
Cy3 和 Cy5 OSu 單功能硫代吲哚花菁琥珀酰亞胺酯（Amersham)
硫代吲哚花菁（cy) 的琥珀酰亞胺酯染料共價結合到游離氨基（賴氨酸側鏈α-氨基末端或 e-氨基）。Cy 染料以凍干態使用，所有情況下保證其處于干燥狀態以避免與水反應。由于批與批之間可能存在差異，每一瓶中染料的量必須單獨測定。在這里所舉的例子中，用俄勒岡綠的琥珀酰亞胺酯（分子探針）來標記 MC5 PKCα抗體。
抗體
待標記的純化抗體，如 MC5(單克隆）或 T250(多克隆），或蛋白質標記反應必須在沒有氨基的緩沖液中進行。許多商用抗體制品中添加了含有可能競爭 Cy 染料的游離氨基添加劑（如牛血清白蛋白或明膠）。也有許多供應商可以根據要求提供不含這些化合物的抗體制品，這種情況下可以要求提供溶于磷酸鹽緩沖溶液中、濃度為 lmg/ml 的樣品。
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠
制備 SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白時，請參考附錄 8
專用裝置
Centricon 濃縮器：YM10,YM30,YM100(分別切割 10、30、100kDa 大小的分子；Amicon)
凝膠過濾/分子大小排阻色譜柱（預裝一次性 Econo-Pac 10DG;Bio-Rad)
蛋白 A-瓊脂糖凝膠柱（Econo-Pac 的 2 ml 柱；Bio-Rad)
用裝料體積 20 倍的 20 mmol/L 磷酸鈉沖洗柱來使柱平衡。推薦用蛋白 G 來純化小鼠抗體。
UV/可見吸收分光光度計
附加試劑
本方案中的第 7 步需要測定蛋白質濃度的試劑（如 Bradford 分析試劑）（Spector et al.1998，第 56 章）。
方法
Fab 片段的制備與純化
1. 采用像 Centricon YM100 的一次性濃縮器，以離心的方法使抗體在含 10 mmol/L EDTA 的 20 mmol/L 磷酸鈉溶液（pH7.0) 中的濃度濃縮至 15~20 mg/ml。
2. 向 250ul 濃縮的抗體制品（約 4~5 mg) 中加入 500ul 消化緩沖液和 500ul 固定在瓊脂糖顆粒上的 50% 木瓜蛋白酶混懸液（分散在消化緩沖液中）。37°C 振搖（振蕩孵化器中，300~400r/min)6~10 h 進行消化。
重要：消化過度（如超過 16 h) 將導致 Fab 片段裂解成較小的多肽。因此建議進行預試驗，毎隔1h 取少量的消化液（約 5ul) 采用還原性 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分桁，在還原條件下，lgG 的重鏈和輕鏈會像 50kDa 和 25kDa 的多肽一樣遷移。經木瓜蛋白酶消化的抗體按約 25kDa 大小的分子遷移。
3. 采用蛋白質 A-瓊脂糖凝膠柱從 Fc 部分和未經消化的抗體中純化 Fab 片段。將消化混合物加到平衡過的柱上，并按每份 1 ml 立即開始收集流過液部分。
蛋白 A 將與抗體的 Fc 部分結合，因此可以從消化混合物中除去全抗體和 Fc 部分，獲得的流過液就僅僅含有 Fab 片段。注意！IgG 分子的許多亞類不與蛋白 A 結合。當需要制備小鼠單克隆抗體的 Fab 片段時，使用蛋白 G。
4. 為了鑒定哪些流過液部分中含有純化的 Fab 片段，測定每一部分的 OD280, 收集并合并 Fab 濃度最高的三個或四個組分。
一般來講，可以在大約 3~4 個組分中發現 Fab 片段。
5. 使用 Centricon YM100 柱（截流值 10kDa;Amicon) 離心將合并的組分濃縮至體積 0.5 ml 以下。
6. 將樣品加到 PBS 平衡的低分子質量（6kDa 以下）凝膠濾過層析柱上，用 PBS 洗脫 Fab 片段（按照產品說明進行)。
為了標記 Fab 片段，必須將它們交換到不含游離氨基（如消化液中必須除去游離半胱氨酸）的緩沖液中。
7. 洗脫后，采用 Centricon 濃縮器使 Fab 片段濃縮后，測定蛋白質濃度。加入 1/10 體積的 1mol/L N-二羥乙基甘氨酸（pH9.0)
采用 Bradford 分析法測定 IgG 濃度，以牛血淸白蛋白作為標準品，并乘以系數 2。
濃縮的 Fab 制品現在就可以準備進行熒光硫代吲哚花菁染料標記。
染料制備
8. 將各瓶凍干染料中的內容物重新混懸于 20ul 的干 N,N-二甲基甲酰胺中，得到濃度約 10 mmol/L 的 Cy 溶液。
9. 將 1ul 染料混合物用 PBS 按 1:10000 稀釋，并由可見吸收峰計算染料濃度。
Cy3 和 Cy5 在 554nm 和 650nm 的吸光系數分別為 150000L?nmol-1 和 250000L?nmol-1。
染料結合
10. 標記蛋白質時，將其混懸于不含游離氨基的緩沖液中。如果蛋白質溶液不是在一種適當的緩沖液中，則按上述第 6~7 步進行操作。
蛋白質如果因穩定性的考慮必須采用持定的緩沖系統，則凝膠過濾系統也采用該緩沖液平衡。注意緩沖成分中不應含有游離氨基或抑制標記反應的成分。值得注意的是，像二硫蘇糖醇、β-疏基乙醇等還原劑對標記反應有干擾。然而，如果為了保持生理/蛋白質功能而必須添加還原劑時，β-疏基乙醇因為干擾較低，因此是首選的還原劑。在 0.1mol/L N-二羥乙基甘氨酸（PH9.0) 中進行標記以前，T(P)250 和 MC5 均需置換到 PBS 中。
建議在標記反應過程中保持堿性 pH 條作（同時保持蛋白質的完整性），以便使賴氨酸的ε-氨基增加質子解離性并因而能有效地結合。
11. 蛋白質樣品（抗體、Fab 片段或蛋白質）與 10~40 倍過量摩爾數的 Cy3 在室溫反應 30 min(按第 8~9 步所描述的進行)。將染料非常緩慢地加入到用移液管尖頭攪拌的溶液中（小心操作以避免染料直接與微離心管接觸)。
為了避免蛋白質因為 DMF 而變性，所加人的 Cy3/DMF 體積必須不超過總體積的 10%。
最佳的過量摩爾數以及反應時間都是根據經驗來確定的。標記的目標是能使毎一個蛋白質分子與 1~3 個染料分子結合（對于標記比例標準的討論，請參閱本方案的導言部分)。對于不同的蛋白質或抗體，其標記水平有很大的變化。如果最終的標記率太低，可能可以重新標記抗體。像 T(p)250 和 MC5 等抗體，已經成功地用超過 40 倍過量摩爾數的染料進行標記。
12. 加入最終濃度為10mmol/L 的含有游離氨基的緩沖液，如 Tris 等來終止標記反應。
13. 采用凝膠過濾柱系統（10DG,Bic-Rad) 來交換緩沖液以除去多余的未反應染料，并將蛋由質洗脫至 PBS 中。
a. 用三倍量填料體積的 PBS 或其他選定的緩沖液（約 30 ml) 平衡柱系統。
b. 為了達到最大分離，將標記反應的混合物直接加到樹脂上，并注意使它的體積越小越好。
c. 用 2.5 ml 緩沖液（上空體積約為 3.3 ml) 清洗柱并廢棄洗脫液。
d. 另外加入 2 ml 緩沖液并收集可見蛋白質組分，將剩余物丟棄。標記產物將跑在前沿，并可以肉眼觀察到，而游離染料從柱上洗脫較慢。
14. 采用 Centricon 濃縮器（可以截流適當大小的分子）再次對標記蛋白質進行濃縮。
15. 采用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析標記產物，以便驗證蛋白質是否成功地被標記。產物經電泳分離后，直接用紫外透照儀（302nm) 檢査凝膠上的可見標記產物。
熒光帶遷移至蛋白質的預期分于質量部位。在電泳遷移的前沿沒有游離染料的熒光；
對于大多數染料，在 302nm 的紫外激發是較好的選擇。如果對凝膠照射時不能看到帶，則可以考慮采用更短波長的激發光。