感 染 CD4+ 原 代 細 胞 系 及 H I V 的誘導 基本方案1 用 H IV 體 外 急 性 感 染CD4 + 原代細胞及細胞系表9.2.1列出了一些最常用于體外H I V 感 染 的 C D 4 + 靶細胞。用其他不同譜系的C D 4 + 細胞系也可獲得相應的結果，還 有 一 些 C D f 細胞在一定的實驗條件下也可被感染。 材 料CD4+細 胞 系（表9.2.1)
與細胞系相適應的完全培養基（如 R P M I -I O 完全培養基；附 錄 1)
基本方案2 建立H I V 慢性感染細胞系材料CD 4 + 細 胞 系（表9.2.1) 與細胞系相適應的完全培養基（如 R P M I -10完全培養基；見 附 錄 1) 9 6 孔 、 4 8 孔 或 2 4 孔圓 底 微 量 滴 定 板（Costar) 1 . 按照基本方案1，步 驟 1?5 , 用 H I V 感 染 C D 4 + 細胞系 2 . 按照基本方案1 ，步 驟 7 , 培養感染的細胞并觀察合胞體及細胞死亡的出現。感染后每兩天檢測反轉錄酶活性以找出病毒產生的高峰時刻（見基本方案，步 驟 8)。 3 . 當病毒產量達到高峰時，將細胞重懸于完全培養基中。以 每 份 0. 2 個細胞/200ul 鋪于 9 6 孔圓底的微量滴定板孔中。不用飼養細胞，進行有限稀釋細胞克隆形成實驗(如 單 元 1. 3)。 由 于 H I V 感 染 ，存 活 的 細 胞 常 丟 失 了 其 CD4 表 面 標 記 。病 毒 慢 性 感 染 并 不 引起 顯 著 的 細 胞 病 變 。 4 . 培養細胞， 7?14 d 后用倒置顯微鏡觀察是否有克隆形成。 5 . 用 4 8 孔 或 2 4 孔圓底微量滴定板擴增一組克隆，通過測定上清中反轉錄酶活性或P24抗原含量來首次篩選H I V 的組成性表達。 6 . 選擇、擴增并凍存高表達H I V 的細胞克隆。 7 . 用細胞系來研究H I V 表 達 的 誘 導（見基本方案3)。 基 本 方 案 3 慢 性 感染 細胞 系 中H IV 的誘導本方案簡述了對持續感染細胞系Ul (從 U 937細胞系產生；表 9. 2 . 1 ) 通過刺激劑進 行 H I V 誘導以檢測這些刺激劑對病毒表達的誘導效應。 材料慢 性 感 染 細 胞 系（見基本方案2) 刺 激 劑（如細胞因子、抗病毒藥物和微生物制劑） 9 6 孔平底微量滴定板或組織培養瓶 1 . 將細胞系在對數生長期維持培養2?3d 。不要讓細胞濃度超過5 X I O 5個細胞/ml。 2.用臺盼藍拒染法估計細胞濃度及活力（附 錄 3C )。如 果 細 胞 活 力 髙（> 9 5 % ) ，在室溫下， 300 g 離 心 lOmin，將細胞按所需的終濃度（如 IX IO5?2 X IO5個細胞/ml) 重
懸于完全培養基中。 3 .將細胞鋪于無菌的9 6 孔平底微量滴定板或組織培養瓶中。 4.加入適當濃度的刺激劑（如 對 9 6 孔 板 加 入 180ul細 胞 懸 液 及 2〇 ul 1 0 倍濃度的刺激劑）。 5.培養細胞，每 24?48 h 收 集 培 養 上 清（至 少 20?30ul ) ，時間> 7 d ，依細胞系而定。上清儲存于一 7 〇 °C ，收集完畢后按步驟 6 檢測。 大 多 數 慢 性 感 染 細 胞 系 在 刺 激 后 4 8 ? 120 h 期 間 被 誘 導 釋 放 的 病 毒 水 平 達 到最高。 6.—次性測定上清中 p24 抗原的含量或反轉錄酶的活性（單 元 9. 4)。圖 9. 2, 2 顯示的是 U l 細胞病毒表達的典型誘導曲線
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