PCR－RFLP法
1）提取細胞總DNA
方法同前。
2）PCR擴增引物的設計
1．引物長度一般為15～30bp，G＋C含量應在45％～55％之間。
2．應避免連續出現4個以上的單一堿基。
3．不能含有自身互補序列。
4．兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體。
5．與非特異擴增序列的同源性應小于70％，或少于連續8個互補堿基。
6．擴增HLA-D區基因多態性區段的引物應在該區第二外顯子或高變區的邊緣。
3）PCR擴增
1．每100μl反應體系中分別加入：緩沖液10μl，引物各25pmol，DNA 1～2μg，10μl dNTPs，混合均勻后在95～97℃變性5～10min。
2．加Taq DNA聚合酶2U，液體石蠟50μl覆蓋放置水分蒸發，將樣品置PCR擴增儀中完成擴增反應，變性，退火，延伸溫度時間及Mg2＋的濃度隨擴增引物及區段的不同而改變。
4）限制性內切酶消化
取5μl PCR產物分別用2個單位限制性內切酶（如HinfI）在總體積為12μl的反應體積中酶解，37℃保溫2～3h。
5）凝膠電泳
12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，200V，3h，用0.5μg/ml溴化乙錠（EB）染色30min，照相分析圖形。