高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜聯用(HPLC―ICP―MS)技術應用于人工養殖富硒海帶中硒的研究

　　實驗前的準備和實驗測定 
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　　實驗器材和試劑準確。（1）實驗儀器與試劑： 1100型液相色譜儀、7500型電感式耦合等離子體質譜儀以及通過PEEK管連接高效色譜柱和ICP-MS霧化器等，色譜自動進樣器。一級水（Milli-Q水，電阻率為18.25MΩ）用來作為全部的標準溶液和樣品制備用水，色譜純硝酸、色譜純甲醇、分析純Tris以及過氧化氫，分析純主要包括鹽酸、檸檬酸、乙醇銨、氫氧化鈉以及己烷磺酸鈉等物質。 
　　（2）標準物質：硒標準品有高純度甲基硒代半胱氨酸、高純度硒代蛋氨酸以及分析純亞硒酸鈉。配置得到1mg/L的硒混合標準儲備溶液，將其保存以便后期進行實驗的過程中使用，混合儲備溶保存在冷藏4℃的溫度下。生物標準物質，茶葉。 
　　（3）標準溶液：混合元素標準溶液的準備，需要Fe，K，Mg，Na，Ca等溶液分別1000g/L以及Ag，Tl，Co，As，Cd，Mn，Cr，V，Al，Pb，Ni，Zn，Cu等溶液分別100mg/L。以為1%的HNO3進行稀釋，得到100mg/L和20μg/L的STD1和 STD2。另外一種溶液，Hg標準溶液的配備，利用2%的HNO3為介質，分別配置1μg/L和2μg/L的Hg，分別記作STD3和STD4。調諧溶液采用Li，Tl，Ce，Y，Co等濃度分別為10μg/L的混合溶液。另外，采用In，Tb，Ge，Sc，Bi，Y和Li濃度分別為10mg/L的混合溶液稀釋得到1mg/L內標溶液。 
　　（4）最后準備富硒前后海帶的兩組樣品，進行研究實驗。 
　　樣品準備。在選擇富硒海帶時，需要針對海帶的質量進行篩選，選擇質量比較好，生長環境較好的海帶，選擇的海帶需要保障質量，保障一定時間內運回實驗室，并且將其放置于海水中，以保持其質量和其中含有的成分，放置的方式足以好選擇掛繩法，在其中添加一定量的Na2SeO3，硒的濃度保障在10mg/L，添加一定濃度的氮磷營養鹽，氮的濃度要保持在300μg/L，磷的濃度保持在30μg/L。同時保持一定的光照強度，水中的鹽度需要在4%，溫度在恒溫2℃，用氧氣泵向水中充氧，每兩天換一次水，一共在實驗室水中養殖10天。同時做一組空白對照，不添加硒，其他條件一樣。最后用一級水將海帶洗干凈，在85℃的溫度下將其烘干，冷卻，樣品經過粉碎均勻后，干燥保存。 
　　樣品硒形態的測定準備。本次試驗采用蛋白酶，0.1mol/L HCl，20mmol/L乙酸銨這三種提取液，分別稱取上述樣品1g，各加入提取液20mL，搖勻，超聲提取30min，轉速9000r/min離心2min，取上層澄清液體過膜，0.45μm，于2mL進樣瓶待用。 
　　樣品的總硒測定準備。樣品利用微波消解法消化，分別取兩組處理好的海帶干粉樣品三份樣品，每份0.5g，將樣品放置在消解罐中，各加8mL硝酸，加蓋，放入微波消解儀消解，溫度升溫程序為120-150-180℃，功率為1600w，消解后趕酸至2～4mL酸液，再進行放置冷卻后，向容器中加入1mL的H2O2，用一級水多次沖洗消解罐轉移樣品，將其定容在25mL，然后測定硒的總含量，同時進行空白對照，不稱取樣品。利用茶葉參考標準物質做質控，與此同時，對77Se，78 Se，82Se三種物質的硒同位素進行測定。 
　　研究實驗結果與分析 
　　海帶脅迫硒培養前后其中各種元素含量的變化和硒含量的變化情況。根據上述的STD3和STD4、混標STD1和STD2為準，做標準曲線，用Li、Bi、Tb、In、Se、Ge、Y各1μg/L的混合溶液作為內標進行測定，測出結果每種元素具有良好的相關線性，標準值測定的結果和參考物質茶葉的各元素測定結果基本一致，證明實驗的結果具有一定的可靠性。海帶（以干基計）空白對照組含硒量為0.281μg/g，經過人工富集培養的海帶硒的濃度達到900μg/g。海帶中的其他元素能夠在硒的富集作用下產生協同效應，并且其中集中元素的濃度會有一定程度的增加。 
　　三種硒形態的色譜系統分離情況比較分析。 
　　在上圖中，A采用第一種色譜系統（C8色譜柱，流動相為檸檬酸和甲醇，流速0.5mL/min）下，第一出峰是亞硒酸鈉，其次是甲基硒代胱氨酸，最后一是硒代蛋氨酸。B第二種色譜系統（C8色譜柱，流動相為水-甲醇，流速1.0mL/min）下，其中分離度比較大的是硒代蛋氨酸和甲基硒代半胱氨酸。最后一種C色譜系統（C18色譜柱，流動相為乙酸銨-甲醇，流速1.0mL/min）下，三個峰能夠在較短時間內出峰完全，同時峰信號強度較強并且峰的形態比價尖銳。以上，第三種系統的效果較優。 
　　RP-HPLC-ICPMS分離法進行海帶樣品硒形態的測定。硒狀態的研究與分析在一定程度上受到提取溶液的影響，利用超聲提取的方式處理樣品，這樣能夠在一定程度上提高效率，以下是按照圖1中的第三種色譜系統進行分離，圖2的ABC分別為用HCL，的乙酸銨溶液以及蛋白酶提取溶液萃取硒形態的出峰圖，進行分離比較。以HCL萃取亞硒酸鈉、硒代蛋氨酸和硒甲基半胱氨酸，效果最佳。 
　　根據上述圖1和圖2可以得知，在利用離子對試劑進行反相液相色譜分離實驗中，提高樣品分離的效率不需要柱前衍生化，其中采用上述提取液與流動相結合C18柱的色譜系統進行提取分離，分離效果比較理想，同時保留的時間比較長，峰形也尖銳不拖尾。 
　　進行人工有目的性的養殖海帶使其富硒，在提高總硒的同時，本實驗也證明有機硒含量也有所提高，而有機硒具有很高的保健價值與防癌作用，結合我國國情，是我國的保健食品行業發展不可或缺的重要部分。其中本次用到的高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜聯用技術在用于人工養殖富硒海帶中研究總硒及硒形態中起到關鍵作用，利用這項技術能夠保障實驗結果的準確性，同時能夠保障實驗能高效率完成，在一定程度上降低時間成本。因此，需要加強對這項試驗技術的研究與運用，為未來海帶硒形態研究實驗打下堅實的基礎。