HPLCICPMS法分析雄黃在大鼠臟器中代謝的砷形態

　　1 引言 
　　近年來，中藥慢性中毒問題受到人們的高度重視。中藥雄黃在我國傳統醫學中有著悠久的歷史，具有解毒殺蟲，燥濕祛痰，截瘧等功效。2010 年版《中國藥典》規定雄黃飲片中As2S2的含量應不低于90%，并對As2O3的量進行了限制。現代醫學研究表明，雄黃在治療白血病、癌癥等惡性疾病方面也有不錯的療效。盡管雄黃具有這種獨特的療效，但由于其屬于含砷礦物藥，使其具有一定的毒性，而其毒性大小與砷的化學形態密切相關。Rana等[7]報道了，砷暴露可通過干擾抗氧化防御系統和減小SOD2 的基因表達，從而對肝、腎造成損傷。 
　　目前，測定砷形態的分析方法主要有高效液相色譜與電感耦合等離子質譜聯用技術（HPLC-ICP-MS）[8～10]、高效液相色譜與氫化物發生 原子熒光聯用技術（HPLC-HG-AFS）、高效液相色譜與氫化物發生 原子吸收聯用技術（HPLC-HG-AAS）、毛細管電泳與電感耦合等離子質譜聯用技術（CE-ICP-MS）、高效液相色譜與電噴霧離子質譜聯用技術（HPLC-ESI-MS），主要用于食品等領域的測定，未見在雄黃代謝中應用的報道。 
　　本實驗建立了HPLC-ICP-MS測定雄黃在大鼠肝腎中代謝砷形態的方法，為研究雄黃在大鼠體內的代謝提供支持，同時考察了樣品前處理過程中砷形態之間的轉化，并運用此法對雄黃在大鼠肝、腎中代謝后的砷形態進行了初步研究，為進一步研究雄黃的藥代動力學提供合適的方法。 
　　2 實驗部分 
　　2.1 儀器與試劑 
　　1200 型高效液相色譜儀及7500a 型電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS，美國Agilent 公司）；Dionex IonPac AS19 陰離子交換柱（250 mm × 4 mm， 10 μm）；Milliplus 2150 超純水處理系統（美國Millipore 公司）；數控超聲清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）。 
　　（NH4）2CO3， NH3/H2O， H2O2（30%）、冰醋酸、NaCl均為優級純；砷標準物質：亞砷酸根離子＼[As]、 砷酸根離子＼[As]、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷甜菜堿（AsB），均購于中國計量科學研究院。超純水（電阻率18.2 MΩ/cm）。 
　　2.2 質譜與色譜條件 
　　ICP MS 條件：RF入射功率1450 W，載氣為高純氬氣，載氣流速0.65 L/min，輔助氣流速0.45 L/min， 射頻電壓1.72 V，采樣深度7.8 mm，泵速0.3 r/s，檢測同位素 75As和35Cl。 
　　HPLC 條件：Dionex IonPac AS 19 陰離子分析柱；流動相： 20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7）；流速：1.2 mL/min；柱溫為室溫；進樣體積：25 μL。 
　　2.3 染毒方法 
　　取4周齡Wistar大鼠4只，體重（50 ± 10）g。分為低、中、高劑量組，給藥劑量分別為0.3， 0.9和2.7 g/kg （以0.5% CMC 為混懸介質），對照組給予0.5 % CMC （羧甲基纖維素鈉），雄黃染毒組灌胃給藥，每天灌胃1 次，連續6星期。染毒期間每3 天稱重1 次，調節灌胃劑量。實驗動物室溫度（24±1） ℃， 相對濕度（50±5）%，每天12 h光照，動物可自由攝食攝水。于末次給藥2 h后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取肝臟和腎臟。 
　　2.4 樣品前處理方法 
　　稱取0.3～0.4 g （精確到0.001 g）粉碎后的試樣，加38 mL 水、2 mL 3%乙酸溶液，渦旋混勻后，60 ℃ 水浴超聲2 h， 于4 ℃ 冰箱中靜置5 min后，取出，于4 ℃以9000 r/min離心10 min，上清液過0.2 μm濾膜。同時制備各試劑空白溶液。 
　　3 結果與討論 
　　3.1 色譜條件的優化 
　　陰離子交換色譜和陽離子交換色譜均可用于砷形態分析。根據砷化合物的離子特性，陰離子交換色譜通常用來分析As、As、MMA 和 DMA，而陽離子交換色譜用于分離AsB、AsC、TMAO 和TETRA。 
　　在陰離子交換色譜中，AsB 和As在中性pH 條件下于死體積處共洗脫。通過向流動相中加入酒石酸后，使As與酒石酸形成陰離子的絡合物，在色譜柱內產生較強的保留特性，從而使As與AsB 分開。也可通過增大pH值至9.0 以上或將As氧化成As實現與AsB 的分離。 
　　本實驗采用Dionex IonPac AS 19陰離子色譜柱，以20 mmol/L （NH4）2CO3 作流動相，對流動相的pH 值和流速進行了優化。