實驗概要
等電點聚焦電泳（IEF）就是在電泳膠中放入載體兩性電解質，當通以直流電時，兩性電解質即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，當蛋白質在此體系中泳動時，不同的蛋白質即聚焦于與其等電點相當的pH位置上，電聚焦的優點是：有很高的分辨率，可將等電點相差0.01-0.02pH單位的蛋白質分開，由于IEF可使用超薄膠，并且其工作原理是建立在蛋白質等電點的差異上，因此分辨率極高，其與SDS－PAGE進行雙向電泳的結果最多可以給出105以上的信息，是目前蛋白質組學研究的主要手段；一般電泳由于受擴散作用的影響，隨著時間和所走的距離加長，區帶越走越寬，而電聚焦能抵消擴散作用，使區帶越走越窄；由于這種電聚焦作用，不管樣品加在什么部位，都可聚焦到其電點，很稀的樣品也可進行分離；可直接測出蛋白質的等電點，其精確度可達0.01pH單位。電聚焦技術的缺點是：一是電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質可能發生沉淀，二 是樣品中的成分必需停留于其等電點，不適用在等電點不溶或發生變性的蛋白質。本部分實驗即要求掌握最基本的IEF原理及具體操作，以適應后基因組時代的研究要求。
主要試劑
樣品提取液（8M尿素、2％非離子型去污劑NP－40、2％Ampholin，pH3.5-10、2％DTT）
膠母液 （30％的29/1的Acr/Bis），兩性電解質
陽極緩沖液 1M磷酸
陰極緩沖液 1M氫氧化鈉
固定液（10％的三氯乙酸、1％的磺基水楊酸）
染色液（35％乙醇、10％冰醋酸、0.15%考馬氏亮藍R250）
脫色液（35％乙醇、10％冰醋酸）
主要設備
高壓電泳儀、IEF槽、離心機等
實驗步驟
1. 樣品提取
1) 1ml原核表達細胞液離心取沉淀
2) 沉淀用100ulIEF樣品緩沖液裂解，離心取上清
2. 制膠
1) 安裝超薄膠裝置
2) 依次加入下述試劑
膠母液 2ml
尿素 8M /脫氣
NP－40 0.2ml
兩性電解質 2ml
10%過硫酸胺 50ul
TEMED 5ul
3) 倒膠
3. 電泳
1) 預電泳膠凝固后，拆卸制膠裝置，將膠連同支持膜一起置于水平電泳槽上（要求，電泳槽面板上首先被液體石蠟浸潤，在凝膠支持膜與電泳槽面板間無氣泡）。
2) 將分別被陰陽極緩沖液浸潤的電極條置于膠面上將與陰陽電極接觸的部位，蓋上電泳槽罩子，連通電源，200V預電泳10min。
3) 電泳，將薄棉紙剪成小塊，輕輕置于預備點樣的膠面上，取10－15ul樣品液，點于薄棉紙上，蓋上罩子，連通電源進行電泳
4) 電泳參數
200V 30min，400V 30min，800V4hr
4. 染色
1) 固定，將電泳完的膠連同支持膜放置于固定液中，10min.
2) 顯色，50℃下，將膠與支持膜放置于染色液中，顯色，直至條帶出現。