實驗概要
免疫組織化學 (IHC) 是確定組織切片上是否存在蛋白及其位置的一種方法。盡管這種方法在定量分析時靈敏度較免疫印跡法或 ELISA 等免疫測定方法低，但它能了解整個組織的情況。適用于癌癥等疾病發展及治療情況的評估。因此，從 IHC 獲得的信 息結合顯微技術提供了一副“宏圖”，使來自其它方法的數據有據可依。
免疫組織化學染色是抗體識別目標抗原的過程。抗體具有高度特異性，只與組織切片上相應的蛋白抗原結合。應用顯色檢測法即能顯示抗原-抗體反應，一種顯色方法是酶結合抗體作為底物，在蛋白抗原位點產生色素沉著，另一種方法是熒光檢測法，即 將熒光染料結合到抗體上，應用熒光顯微技術檢測。
實驗步驟
1. 固定
正確的固定是免疫組織化學法的關鍵。最常用的是 10% 中性甲醛溶液 (NBF)。Abcam 說明書推薦 IHC-P 使用該固定劑，另有說明的除外。
其它不常用的固定劑還有多聚甲醛 (PFA) 或 Bouin's 液（甲醛/苦味酸）等。
理想的固定時間取決于組織切塊的大小和類型。對于大多數組織來說，通常固定時間在 18-24 小時之間較為理想。固定不足可能導致組織切片邊緣有染色信號強，中間無信號。固定過度將會屏蔽抗原表位。雖然抗原修復有助于克服屏蔽作用，但如果固定時間太長（比如一周）那么抗原修復也無濟于事。
固定后，將組織塊包埋于石蠟中，用切片機切成理想厚度（依據組織一般大約在 5-20 微米）的切片，然后將切片附著在玻片上。組織切片最好封固在正電荷吸附或 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷 (APES) 包被的玻片上，室溫過夜，脫水并徹底干燥。如果切片不能很好的附著在玻片上，可以將其與玻片共同置于 60 °C 孵育數小時。
2. 脫蠟
將切片置于架子上，依據下列方法依次沖洗：
1) 二甲苯：2 X 3 分鐘
2) 二甲苯與無水乙醇 1:1 混勻：3 分鐘
3) 無水乙醇：2 X 3 分鐘
4) 95% 乙醇：3 分鐘
5) 70 %乙醇：3 分鐘
6) 50 % 乙醇：3 分鐘
7) 冷水流洗
3. 抗原修復
1) 將合適的抗原修復緩沖液加入高壓鍋內，然后將鍋置于加熱板并開至最大功率，此時不要把蓋子蓋緊。在等待煮沸過程中，按上所述對切片脫蠟至水。
2) 煮沸后，將玻片從自來水中移到高壓鍋內。小心熱溶液-使用鑷子。依照說明書加上加壓閥。
3) 高壓鍋達到最大壓力后（見用戶說明書），維持 3 分鐘（見注意事項 1）。
4) 3 分鐘后，關掉加熱板，取下高壓鍋。
5) 打開高壓鍋閥門（見用戶說明書），冷水冷卻鍋身。壓力降下后，打開鍋蓋，冷水冷卻 10 分鐘。小心熱溶液（見注意事項 2）。
6) 參照免疫組織化學染色說明書繼續染色。
4. 免疫組織化學染色
1) 操作方法
a. 若使用 HRP 標記二抗檢測，則需要封閉內源性過氧化物酶，但我們建議在開始一抗孵育前不予理會。
b. 在含 0.025% Triton X-100 的 TBS 中漂洗玻片 2×5 分鐘 ，輕輕震蕩。
c. 用含 10% 正常血清、1% BSA 的 TBS 室溫封閉 2 小時。控干封閉液（不是漂洗），并用紙巾將玻片周圍擦干。
d. 一抗用含 1% BSA 的 TBS 稀釋后加到玻片上。
e. 4 °C 孵育過夜。
f. 用含 0.025% Triton X-100 的 TBS 漂洗 2 X 5 分鐘，并輕輕震蕩。
g. 若使用 HRP 標記二抗檢測，則需將玻片在含 0.3% H2O2 的 TBS 中孵育 15 分鐘以封閉內源性過氧化物酶。
h. 酶法檢測（HRP 或 AP 標記二抗）：
i. 在 TBS 中漂洗 3 X 5 分鐘。
j. 若采用熒光檢測，則結束此步后就可以用封固劑和蓋玻片進行封固了。
k. 若采用底物顯色，則還需繼續進行下述操作。
l. 室溫下與底物作用 10 分鐘。
m. 流水沖洗 5 分鐘。
n. 復染（如果需要）。
o. 脫水，擦干并封固。
2) 對照
為了評價非特異性交叉反應和 Fc 受體結合的影響，與一抗同型但不相關的抗體（如 BrdU）將用來做對照。與不相關抗原結合的抗體稱為同型對照。對于全血清抗體而言，對照抗體是來源于同種動物的未免疫正常血清。
如果沒有同型對照，可用陰性對照代替，即以抗體稀釋液代替一抗。強力推薦陽性組織對照，確保抗體達到預期效果。根據實驗需要，也可設陰性組織對照，在該組織中應沒有目標蛋白存在的。
3) 信號放大
為得到較強的信號，可采用多種策略將更多的酶或熒光染料結合到目標蛋白上。
a. 卵白素-生物素 (ABC)
該技術是由 Su-Ming Hsu 及其同事 (J Histochem Cytochem. 1981 Apr 29 (4):577-80) 共同建立的。卵白素是在雞蛋清中發現的，與生物素有高親和力，有 4 個生物素結合位點，并且這種結合是不可逆的。生物素是羧基化反應中酶的輔助因子。
簡言之，先將一抗結合到目標蛋白上，再將生物素標記二抗結合到一抗上。另一反應系統中，將卵白素與生物素化的酶按一定比例混合形成卵白素-生物素-酶復合物，并且使卵白素上保留一定的未結合位點。切片與抗體孵育后，再與此復合物共同孵育，使復合物卵白素上未結合位點與生物素化的二抗結合，相比較酶標二抗或一抗而言可以使更多的酶接觸底物。
卵白素-生物素復合物有市售試劑盒，提供有兩種試劑及結合最佳比例的說明。該復合物適用于 Abcam 推薦的所有生物素化抗體。注意有些組織中存在的內源性生物素，如腎臟、肝臟、大腦、前列腺、結腸、腸、睪丸等會與卵白素-生物素復合物結合導致背景染色 (Wang and Pevsner, Cell Tissue Res. 1999 Jun;296(3):511-6.).
b. 標記的鏈霉生物素 (LSAB)
該方法同 ABC 法相似，它利用了鏈霉親和素（親和力與生物素相似）和生物素之間的相互作用。一抗與生物素標記的抗 Ig 二抗結合后，再與結合在酶或熒光染料上的鏈酶親和素結合。Abcam 提供有鏈霉親和素-HRP 結合物，ab7403。
應用鏈霉親和素代替卵白素可以使非特異性背景染色更少，因為鏈霉親和素是非糖基化的（卵白素不是），不會與凝集素或其它糖結合蛋白反應。文獻報道 LSAB 法比 ABC 法靈敏 4-8 倍，詳見 Giorno R, Diagno Immunol.1984;2(3):161-6。
c. HRP 聚合物
將二抗與聚合物-酶復合物結合形成的新型聚合物-酶-抗體產物（如抗鼠和/或兔 IgG）優于上述兩種卵白素-生物素法（ABC 和 LSAB）。因為此種方法比上述兩種方法減少一步，并且避免了組織內源性生物素的干擾。Abcam 提供有羊抗兔/鼠 IgG HRP 多聚物，ab2891。