(一)原理
IL-8對中性粒細胞具有激活和趨化作用,通過檢測中性粒細胞的遷移距離可以確定IL-8的生物學活性,即對中性粒細胞的趨化活性。
(二)材料
(1)6%右旋糖酐生理鹽水溶液。
(2)淋巴細胞分層液比重為1.077+(-)0.001。
(3)2%瓊脂糖:稱取2g瓊脂糖,加入到100ml蒸餾水中,煮沸溶解。
(4)0.1%白明膠Hank’s液。
(5)DMEM培養液(2×濃縮),內含20%FCS和0.75mg/mlNa2CO3溶液。
(6)甲醇溶液、Wright-Giemsa染液。
(7)潔凈載玻片。
(8)打孔器,直徑為3mm。
(三)方法
(1)IL-8的誘生
①常規分離PBMC,洗滌后,調細胞濃度為5×106/ml。
②將細胞接種于24孔細胞培養板,每孔0.5ml。
③加誘生劑LPS(20ug/ml),每孔0.5ml,37度,5% CO2孵育48h。
④ 離心收集細胞培養上清液,用HCl溶液調為酸性(PH4.0),經SephadxG-75柱分離,收集活性組分即為待測的IL-8粗品。
(2)IL-8的生物活性檢測
①瓊脂板的制備;取溶化后50度左右保溫的2%瓊脂糖與等體積50度水浴預溫的DMEM培養液(2×濃縮),混合,取3ml加到潔凈的載玻片上,鋪成薄層,室溫凝固后,放4度,進一步凝固30~60分鐘,紅打孔器打孔。
②中性粒細胞制備:常規分離人外周血中性粒細胞。
③加樣:取10ul中性粒細胞懸液加入瓊脂板各組中心孔,分別取10ul待檢樣品及陽性對照品加入樣品孔,取10ulDMEM培養液加入對照孔;將玻片置于濕盒內,37度溫育2小時。
④染色:用甲醇溶液固定30分鐘,用瑞氏染液染片并干燥。
⑤檢測:顯微鏡下分別測量細胞從中心孔向樣品孔游走的距離(趨化游走距離)及向陽性對照孔的游走距離(自發游走距離),趨化活性以趨化指數表示。
趨化指數=趨化游走距離/自發游走距離
(四)關鍵點
為確認待檢樣品中IL-8的特異性趨化效應,最好同時比較抗IL-8抗體與待測樣品作用后的趨化結果。