IgG的分離與提純：硫酸銨沉淀法

實驗概要

實驗室中常用硫酸銨沉淀后過DEAE 纖維素柱，比較簡便可獲較純的抗體。下面以此方法為例介紹IgG的分離與提純。

實驗原理

以抗原免疫動物來制備的抗血清是一個非常復雜的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗原特異性結合的抗體則主要是血清中的免疫球蛋白組分。通常用于制備酶標抗體或熒光抗體的免疫球蛋白必須高度純化并具有特異性，不應含有非抗體的血清蛋白。因此，為了濃縮和提高抗體的效價，或為制備免疫球蛋白特異性抗體時，通常也需要分離和純化免疫球蛋白。γ球蛋白(IgG)是血清免疫球蛋白的主要成分，約占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗體的分離純化主要是分離純化IgG。

純化IgG小量幾十ml的話，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以純化；大量的話，上百ml，可以使用streamline protein A。之前根據載量估計一下需要的柱子體積。

主要試劑

1. 硫酸銨飽和溶液

   硫酸銨800g~850g

   H₂O 1 000ml

   加熱至絕大部分溶質溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然后以28％NH₄OH調pH至7.0(不調pH值也可以)。

2. 0.01Mol/L pH7.4PB液

   A液：0.10Mol/L NaH₂PO₄液

   NaH₂PO₄·2H₂O 15.60g

   加H₂O至1000.ml

   B液：0.10Mol/L Na₂HPO₄液

   Na₂HPO₄·12H₂O 35.80g

   加H₂O至1 000ml

   取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。

3. 1%BaCl₂溶液

4. 納氏液

   HgI 115.00g

   KI 80.00g

   加H₂O至500.00ml

   溶化后過濾，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。

5. 0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液

6. 洗脫液

   0.03Mol/L的NaCl液。

主要設備

1. 透析袋(或玻璃紙)

2. 低溫冰箱

3. 高速離心機

4. DEAE－纖維素層析柱

5. 醋酸纖維膜電泳裝置

實驗材料

1. 動物血清

實驗步驟

1. 取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入(NH₄)₂SO₄飽和溶液10ml，使成20%(NH₄)₂SO₄溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。

2. 3000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。

3. 在上清液中再加(NH₄)₂SO₄飽和溶液30ml，使成50%(NH₄)₂SO₄溶液，充分混合，靜置30min。

4. 3000r/min離心20min，棄上清。

5. 于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH₄)₂SO₄飽和溶液10ml，使成33%(NH₄)₂SO₄溶液，充分混合后，靜置30min。

6. 3000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復步驟5，2~3次。

7. 用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。

8. 透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數次。

以1%BaCl₂檢查透析液中的SO₄^2-或以納氏試劑檢查NH₄ (取3~4ml透析液，加試劑1~2滴，出現磚紅色即認為有NH₄ 存在)，直至無SO₄^2-或NH₄ 出現為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。

9. 離心去沉淀(去除雜蛋白)，上清液即為粗提IgG (即γ球蛋白，如以36%的飽和硫酸銨沉淀血清的產物即為優球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。

10. 過DEAE－纖維素層析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脫，收集洗脫液。也可采用SephadexG150或G200柱。

11. 蛋白質及其定量鑒定。

12. IgG的純度鑒定可采用下列方法之一鑒定。

   1) 區帶電泳

玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳后，只在γ—球蛋白的遷移部位出現一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度(NH₄)₂SO₄鹽析樣品進行電泳，以資比較。

   2) 瓊脂雙相雙擴散鑒定

預先準備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現一條沉淀線。

   3) 免疫電泳鑒定

孔內加待測樣品，電泳后，在槽內加抗IgG血清，瓊脂擴散24h，觀察結果。如果提取的IgG純的話，則只出現一條弧形的沉淀線，且沉淀線位于γ—球蛋白區。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。

   4) 圓盤電泳鑒定

用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現數十條區帶，而純化的IgG則只有一條區帶。

13. IgG的濃縮與保存

   1) IgG的濃縮

   2) IgG的保存

一般濃縮至1%以上的濃度，再分裝成小瓶凍干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存。

注意事項

1. 硫酸銨以質量優者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H₂S，靜置過夜后濾過，加熱蒸發H₂S即可。

2. 防止物品反復凍融。