JohnYates專訪：探索質譜與信息學之間的奇妙關系

　　計算機對質譜的發展一直起著巨大的影響。從數據采集到儀器操作再到數據分析，計算機在質譜發展史中的多個關鍵時刻都起到了積極推動作用。串聯質譜和信息學的結合，使蛋白質組學能夠快速將氨基酸序列與質譜圖進行歸屬。

　　隨著分析工具的日漸發展、數據生產數量與數據類型的逐漸多樣化，計算機信息的處理能力也在不斷增長以與數據發展相適應。人們正在將高級的工作流程用于處理蛋白質組實驗，包括數據的搜索、定量和統計分析。如今質譜儀又增加了離子淌度這一新的維度，這為數據采集、肽段的信息注釋提供了更強的分析能力。IP2是一個蛋白質組學平臺，它創建了一個結合GPU搜索、靈活定量和數據統計分析的工作流程。

　　Technology Networks近期與John Yate教授和Robin Park博士進行了訪談,以了解有關他們所開發軟件IP2的更多信息,及其在蛋白質組學研究中的作用。(https:/www.technologynetworks.com/)

Q：請告訴我們質譜與計算機之間不斷發展的關系？

　　多年來，質譜分析和計算機存在著一個有趣的關系。有一個概念被稱為“鄰近可能”(由Stuart Kauffman在2002年提出)。他指出，在任何限定的相鄰時間范圍內，一起協作的事物都會逐步的發生演化并產生創新。這個想法與質譜發展極為相似。若回顧質譜的發展歷史，我們會發現，許多質譜的早期工作也是正在開發計算機的學術機構中進行的。

　　這促使了人們逐漸在各種研究項目中使用計算機，例如計算復雜而精確的分子質量。 最終，技術的發展讓人們開始使用計算機記錄質量，淘汰了傳統的相機底片。隨著時間的推移，計算機程序開始更高效地處理數據，讓人們從中獲得了更多的有效信息。

Q：眾包和當前技術在質譜學發展中有多重要？

　　非常重要。在計算機技術發展的同時，人們意識到需要避免重復解釋質譜圖。這促使人們誕生了創建譜圖庫的想法，這些譜圖庫中的信息是已經被人們注釋過的，而這種做法實際上開啟了圖庫搜索的概念。這是科學界“眾包”已知的早期例子。

　　在當時，計算機并沒有裝配大量的存儲空間或內存，因此搜索程序必須設計的非常智能，以減少搜索譜圖庫所需的信息和技術壓力。計算機控制的數據采集被依賴數據采集所替代，然后是獨立數據采集，最終允許計算機對肽段進行大規模分析。現在人們可以處理肽和氨基酸序列條形碼的串聯質譜圖，并用它來掃描數據庫并識別所代表的氨基酸序列。

　　這種新的分析方法讓高通量和大規模實驗更能適應高度復雜的生物系統，包括蛋白質復合物、細胞器、細胞和相關組織。同時，這會產生更多的數據和并需要更多的分析，需要人們有更充分的準備。

Q：信息學的發展如何影響質譜的發展潛力？

　　質譜技術的發展給我們收集、分析、組織和解釋數據的能力帶來了很大壓力。這就使信息學變得尤為重要，從數據提取、搜索引擎、定量分析到驗證工具，置信度評分工具和數據存儲庫變得司空見慣——后者經常使用Microsoft Excel作為存儲介質。然而它并不理想，所以一直以來，我們在逐步放棄使用。

　　能夠在實驗室中使用數據對我們來說非常重要，因此和布魯克合作，我們一直在開發蛋白質結構分析和基因富集分析工具。

Q：您能介紹一下IP2平臺嗎?

　　幾年前，我們在多款數據提取工具之間進行了比較，發現它們的功能存在很大的差異。 這是流程中最重要的步驟之一，但是擁有這么多軟件工具的問題在于，很難在整個工作流程中實現完美的兼容性。為此，我們成立了一家名為Integrated Proteomics Applications的公司，開發了一個名為Integrated Proteomics Pipeline（IP2）的工作流框架。這個框架背后的想法是，我們可以將人們在學術界開發的工具（免費且開源的工具）放入到這個IP2框架中，創建了一個集成數據分析工具的簡化工作流程。

　　IP2是一個中間層程序，它用于管理分析、譜圖質量控制、后端層、到鏈接云和集群計算、數據存儲和備份。用戶可以使用計算機、手機或平板電腦訪問他們的數據或查看進程狀態。 IP2也可以通過開發人員工具包進行設置，這意味著用戶可以調整IP2平臺以與其它軟件和應用程序協同工作。

　　IP2可以用于大規模并行蛋白質組學數據分析，我們已經能夠通過亞馬遜網路服務系統、谷歌和微軟云系統將我們的平臺與云計算結合。我們還將我們的實驗室系統和云系統，通過高性能GPU集群來提高平臺的分析速度和效率。

Q：GPU如何影響IP2的性能？

　　IP2允許使用GPU搜索引擎而不是CPU搜索引擎。相較之下GPU速度更快。一個GPU卡上擁有數千個GPU核心，用戶可以添加更多的GPU卡來提高速度。GPU搜索數據庫的速度驚人，并且GPU的數據庫搜索能力也會隨計算能力增長而提高。

圖：基于GPU計算的IP2將數據處理速度提升百倍

　　我們一直在考慮使用雙重搜索來提升數據質量，并希望將此功能整合到IP2中。在這里，您將搜索到的DDA數據傳遞至序列數據庫，然后使用該數據構建相關數據庫。再使用該庫再次搜索DDA數據。這種方法可以顯著提高數據的再現性，GPU內核的使用即為我們實現了此目標。

Q：timsTOF質譜平臺如何與IP2集成?

　　布魯克的timsTOF是測量離子淌度的極佳工具。這類質譜可為我們提供有關離子三維結構的信息，有助于提高峰容量和化合物表征的可靠性。我們一直在為timsTOF優化我們的平臺、工具和搜索引擎，特別是圍繞如何從timsTOF的原始文件中提取數據的過程這個問題，這些原始文件信息量著實不小。

　　通過這項工作，我們建立了一個強大的提取程序：timsTOF Extractor，ProLuCID搜索引擎（使用我們之前提到的GPU技術），Census定量分析應用程序和用于timsTOF的PaSER（并行實時數據庫搜索引擎）。

Q：在開發宏蛋白質組學和微生物組數據分析搜索引擎工時有哪些挑戰？

　　微生物組數據庫龐大，處理微生物數據具有極大的挑戰性。目前它的大小約為70G，并且還在不斷增長。在傳統的搜索策略中，使用這種方法搜索大數據是很困難的。為了解決這個問題，我們與Scripps研究所的Dennis Wallen合作開發了ProLuCID-ComPIL搜索引擎。

　　ProLuCID-ComPIL引擎使用NoSQL對數據進行預分類和預分析，以縮短用戶搜索時間。 這些算法和搜索過程也可以與PTM和序列變量一起使用，把它們傳輸到索引數據庫中，然后使用GPU對其進行高速搜索。我們與加州大學圣地亞哥分校的Yu Gao親密合作，使用他的譜圖校準工具Dilu，我們可以專心把注意力放在代謝組學上。

Q：您能告訴我們更多有關PaSER系統的信息嗎？

　　我們的PaSER系統是一個并行數據庫搜索引擎，可以實時工作。由于許多儀器配套軟件掃描速度非常快，生成大量譜圖，因此實時搜索的一個關鍵優勢是省略了數據提取步驟--你只需直接從質譜儀中獲取數據，然后立即搜索，無需再上傳數據。

　　我們研發的PaSER系統速度足夠快，可以同時接受多個儀器數據，當然了，我們使用PaSER平臺的目標不僅僅是實時搜索。希望能繼續解決實時搜索功能方面存在的更多挑戰。傳入搜索引擎的儀器掃描速度要想提高，搜索引擎的速度至關重要。與IP2平臺一樣，PaSER使用GPU內核而不是CPU內核，比傳統搜索速度更快。這意味著可以將數據從儀器實時發送到IP2-GPU中心，并且在實驗完成后立即獲得數據庫搜索結果。

Q：與傳統的離線搜索相比，如何評價PaSER在速度方面的提升？

　　為了評估PaSER的性能，我們在timsTOF Pro上運行了200納克的HeLa細胞樣品。整個過程我們重復進行了六次。第一次實驗是使用實時搜索，第二到第四次沒有使用，在第五和第六次實驗中使用了兩次實時搜索。這項實驗的目的是識別掃描速度是否滯后，并檢查使用實時搜索是否會影響成功識別的次數。

　　通過實驗我們發現，使用實時搜索不會影響掃描性能。最后，我們還發現使用實時搜索能獲得與離線搜索相同數量的結果。

　　此外，我們還評估了離線搜索所花費的時間。有時，在使用實時搜索之后，可能會再次使用不同的參數在不同的數據庫中繼續搜索。這種情況下，用戶并不需要轉換原始數據，因為最初的實時搜索已經保存譜圖信息并將其傳輸到數據庫。在我們的演示中，每次使用IP2-GPU引擎搜索，只需花費3分鐘。

Q：Smart Precursor Selection工具是如何改善搜索過程的？

　　PaSER的智能預選工具能夠實現PaSER與儀器間的雙向聯系。根據不同目標，能實現更多的創新。例如，我們可以使用此工具來實現排除列表。 這個想法很早就有了，但是由于并不容易實現，所以并不受廣大用戶歡迎。過去，用戶必須在搜索結果中手動收集肽段ID，再手動輸入到排除列表。隨著項目的發展，人們依然將重復這個復雜的過程。

　　現在，PaSER可以從第一個實驗開始就自動建立排除列表，然后將此表傳遞給第二個實驗，依此類推，每次的迭代都會完善排除列表。這種方法使我們的搜索和實驗隨著時間推移產生更準確的結果。

　　另一個是儀器環境溫度變化或校準問題而引起的質量漂移動態管理。通過使用PaSER的實時搜索功能，我們可以測量理論和實際肽的母離子間質量差。然后，通過將增量質量發送回儀器中，實現實時校準離子質量漂移。這意味著無論我們完成十次運行還是一百次運行，質量校準始終是最新的。

　　當我們使用基于MS1的定量分析進行標記時，我們經常會看到同一肽的輕離子和重離子。對于定量分析，因為我們已經知道輕離子和重離子之間的質量差，所以不需要同時使用兩種前體離子，一個就足以定量樣品。

　　在實時搜索過程中，我們就能確定到底是在處理重肽還是輕肽，然后我們可以動態排除另外一對，也不會因此生成多余的譜圖。

　　我們還可以使用這項工具來處理工作站中的特定標簽，例如AHA標簽或TEV標簽。 其中，AHA標簽可以標記蛋氨酸，而TEV標簽可以標記半胱氨酸。根據UniProt數據庫計算，大約65%的肽不含半胱氨酸或蛋氨酸，利用這些數據，我們可以實時排除許多肽段，并根據需要進行選擇性掃描。

Q：PaSER如何適應動態PASEF譜圖和實時定量？

　　PaSER可以使用PASEF技術或并行累加串行分段作為其操作的一部分。在每個PASEF循環中，我們能通過構架來構建PASEF掃描。若根據離子豐度，一個PASEF循環可能會因缺少足量的離子導致無法獲得結果。而我們的實時搜索功能可以實時評估譜圖。如果引擎在檢查中發現需要掃描更多信號時，則可以通過添加更多構架來加強信號。

　　以前，我們需要知道峰值才能有效觸發串聯質譜圖，現在可以在實時搜索過程中通過評估譜圖來確定峰值后，僅觸發母離子實現這一點。我們也可以在最合適的時段從排除列表中動態刪除無用的離子。

　　最后，我們利用timTOF開發實時定量功能。該功能通過離子淌度來計算肽的量，可以代替以往的XYZ峰面積。我們還可以從實時搜索中分離具有ID的共洗脫肽/肽段，這意味著人們可以實現并行定量分析。如果在進行多個實驗時，我們可以在實驗間建立匹配關聯。這些都是PaSER雙向聯系功能創造性使用的優秀范例。

Q：IP2和布魯克的其他平臺在更廣泛的數據和知識行業中處于什么樣的位置？

　　現在，我們擁有各種各樣的工具，可以對質譜數據進行分類和識別 。當然，我們的總體目標是更好的進行生物探索。考慮到這一點，我們將應用程序鏈接到諸如Reactome等數據分析工具，其中有許多工具可以在互聯網中免費使用。有一些工具能探索基因本體論的輸出，例如，通過選擇最重要的20個類別，同時在生成的原始文件中保留所有類別的信息，接下來可以直接進行下一步檢查而無需重新分析。

　　Mathieu Lavallée-Adam和他的團隊為我們開發了一種內部工具——PSEA-Quant，專門用于蛋白質集富集分析，是專為基因集富集分析而開發的，但已針對無標記和基于標記的蛋白質定量數據進行了優化。

　　總體而言，協調分析平臺和研究工具之間的兼容性是我們工作的重點。