LCMS技術臨床應用培訓班報告（二）

　　分析測試百科網訊2016年4月20日，液相色譜-質譜（LC-MS）技術臨床應用培訓班在上海中山醫院舉辦。紐約州羅徹斯特大學臨床質譜實驗室主任兼北美華人臨床化學學會（NACCCA）主席張巖教授、金域臨床質譜檢測中心趙蓓蓓、中國科學院生物物理研究所李巖、廣州金域臨床質譜檢測中心主任程雅婷、復旦大學附屬中山醫院檢驗科副主任郭瑋、徐匯區中心醫院中心實驗室副主任李水軍教授和中國科學院研究生院訾金等都帶來了精彩的報告。（相關鏈接：LC-MS技術臨床應用培訓班報告（一））

會議現場

中國科學院生物物理研究所 李巖

　　李巖：中國科學院生物物理研究所研究員，中國科學院引進杰出技術人才，美國馬里蘭大學分析化學博士，從事臨床診斷新方法新技術的開發應用。

　　中國科學院生物物理研究所李巖帶來了題為《LC-MS/MS的實驗方法開發》的報告。李巖表示實驗方法設計原則首先要確定實驗目的， 檢測內容要確定：組學檢測還是目標分子檢測？大分子還是小分子？檢測要求：定性還是定量？檢測通量，試劑成本等具體要求？

　　目標蛋白質的定性實驗方法，目標蛋白質定性的基本實驗過程：電泳分離，膠內酶解，質譜鑒定，數據分析。在目標蛋白質的定量實驗方法中，李巖介紹到目標蛋白質定量方法的原理可采用質譜多反應監控技術和同位素多肽合成技術。在蛋白質組學的定量實驗方法中，李巖介紹到基于質譜譜圖數據的相對定量方法；同位素標記法（iTRAQ, O18、TMT等）；細胞同位素標記法（SILAC）；SWATH模式等蛋白質組學的常見定量方法。在目標代謝物的定性實驗方法中，李巖介紹到準確分子量分析和標準譜圖比對的代謝物定性原理。在目標代謝物的定量實驗方法中，李巖介紹到質譜多反應監控技術和同位素內標定量原理。在代謝組學的定性實驗方法中，李巖還談到糖組學的定性實驗方法等。

金域臨床質譜檢測中心 趙蓓蓓

　　趙蓓蓓：廣州金域臨床質譜檢測中心副主任,具有豐富的臨床色譜質譜檢測技術經驗，主導和參與本中心臨床色譜質譜類新項目開發三十余項。

　　金域臨床質譜檢測中心趙蓓蓓帶來了題為《LC-MS/MS定量檢測方法建立與評估的基本要求》的報告。趙蓓蓓介紹到LC-MS/MS技術臨床應用的主要訴求點，由于免疫學方法的局限性，LC-MS/MS技術在臨床應用方面具有明顯的優勢，可用于遺傳代謝病（血液氨基酸和酰基肉堿）、內分泌疾病（類固醇類激素）、營養素監測、毒理學和濫用藥物監測、疼痛管理、治療藥物監測（免疫抑制劑等）、蛋白質鑒定和定量等。

　　趙蓓蓓介紹到在LC-MS/MS方法建立前，需要考慮目標物的分析；內標物的選擇；設備、試劑及環境條件等準備等。LC-MS/MS定量檢測方法建立需要信息及文獻檢索、質譜方法建立、液相色譜方法建立、樣品前處理方法建立、方法建立的其他考慮-基質效應。另外，趙蓓蓓還介紹了LC-MS/MS定量檢測方法驗證基本要求。

紐約州羅徹斯特大學臨床質譜實驗室主任兼北美華人臨床化學學會（NACCCA）主席 張巖

　　張巖：紐約州羅徹斯特大學臨床質譜實驗室主任，病理和臨床醫學系副教授，美國臨床化學學會（AACC）質譜和分離分委會主席，北美華人臨床化學學會（NACCCA）主席。

　　紐約州羅徹斯特大學臨床質譜實驗室主任兼北美華人臨床化學學會（NACCCA）主席張巖教授帶來了題為《液相色譜-質譜聯用技術的臨床應用現況及未來發展趨勢》的報告。張巖介紹了當前臨床質譜技術的應用，主要以小分子為主，例如氨基酸、有機酸、類固醇、生物胺和藥物，和一些蛋白質/肽。質譜技術總體趨勢和方向是：性能越來越多，儀器尺寸由大變小，低檢測限，大分子，高分辨率，由CP向AP轉變，工作流由人工向自動化轉變。

　　張巖表示質譜技術是一種新興的技術，越來越多的應用在臨床實驗室。選擇正確的儀器需要理解質譜的基本原理。在將質譜帶到臨床實驗室時，應考慮到人力和財力幾方面的問題，這也是最具挑戰性和最復雜。

廣州金域臨床質譜檢測中心主任 程雅婷

　　程雅婷：廣州金域臨床質譜檢測中心主任、廣州醫科大學金域檢驗學院副教授；多年臨床質譜實驗室工作和管理經驗。

　　廣州金域臨床質譜檢測中心主任程雅婷帶來了題為《遺傳代謝病串聯質譜檢測介紹》的報告。程雅婷介紹了遺傳代謝病發病機制、遺傳代謝病檢查、遺傳代謝病治療原則。在串聯質譜技術在遺傳代謝病檢測中的應用中，程雅婷介紹到串聯質譜檢測干血斑中氨基酸和酰基肉堿，金域遺傳代謝病實驗室檢查流程。在串聯質譜遺傳代謝病檢測項目建設中，程雅婷介紹到串聯質譜技術檢測遺傳代謝病的特點，項目建設難點，遺傳代謝病項目質量控制。

復旦大學附屬中山醫院檢驗科副主任 郭瑋

　　郭瑋：復旦大學附屬中山醫院檢驗科副主任，上海醫學會檢驗醫學分會質譜學組組長，從事質譜檢測在臨床診斷中的應用研究。

　　復旦大學附屬中山醫院檢驗科副主任郭瑋帶來了題為《液相色譜-串聯質譜在臨床激素檢測中的應用》的報告。報告闡述了質譜方法對于小分子多肽激素類物質檢測較免疫方法具有特異性、準確性好及檢測效率高的獨特優勢，是目前世界上公認的檢測激素類物質的較好檢測方法。郭瑋教授介紹了中山醫院檢驗科利用質譜方法檢測多種激素類物質，建立了技術平臺、質譜方法的性能驗證，以及不同方法學的影響因素。在臨床實驗室中，中山醫院檢驗科是國內為數不多的將質譜技術應用于激素檢測的實驗室之一，通過不斷將新技術在臨床診療中應用和推廣，為實踐精準醫療提供助力。

　　 自2011年起成為國家首批臨床重點檢驗專科，受其資助建立了LC-MS/MS法檢測MNs的技術平臺，最低檢測下限可達到20pg/ml。還分別建立了本實驗室MNs的參考范圍（MN<62.96pg/ml；NMN<191.15pg/ml）和嗜鉻細胞瘤特異性診斷切點（MN>139.38pg/ml；NMN>369.05pg/ml）。參考范圍上限結合特異性診斷切點的診斷策略有助于嗜鉻細胞瘤的明確診斷或排除診斷。目前MNs的年檢測量已超過2500例，不但大大提高了臨床靈敏度和特異性，檢測速度和報告時間也明顯加快，切實解決了多年來困擾臨床的嗜鉻細胞瘤診斷缺少理想實驗室檢測指標的難題。

徐匯區中心醫院中心實驗室副主任 李水軍

　　李水軍：徐匯區中心醫院中心實驗室副主任，中國科學院上海臨床中心研究員，長期從事質譜技術在臨床診斷的開發與應用、臨床藥物分析等研究。

　　徐匯區中心醫院中心實驗室副主任李水軍教授帶來了題為《LC-MS/MS在治療藥物監測的臨床應用——以地高辛應用舉例》的報告。李水軍介紹到治療藥物監測（TDM）是通過定量測定生物樣品中藥物濃度，以評估藥物治療依從性、療效或者解釋藥物引起的毒性原因的多學科的臨床行為。TDM的目標是將藥物濃度控制在治療窗內。LC-MS/MS法開展TDM的優勢是分析特異性和靈敏度較好，可同時檢測多個藥物（藥物和代謝物），靈活性大

　　通量較高，節省成本；不足是自動化程度低，需要嚴格的方法驗證，缺乏牢固性，缺乏全時段的技術服務。需要從特異性、靈敏度、成本和通量解決現有的問題。

　　在LC-MS/MS用于地高辛的TDM應用實例中，李水軍介紹到LC-MS/MS方法學驗證，免疫法與質譜法的結果比對，免疫法與質譜法的總體差異分析，質譜法與免疫法的相關性分析，符合度分析，不同免疫法及不同廠家之間的差異，方法內差異分析等。

華大基因研究中心 訾金

　　華大基因研究中心訾金帶來了題為《運用SWATH/MRM聯合技術探索與驗證食管鱗狀細胞癌生物標志物》的報告。訾金表示研究蛋白質生物標志物過程中，基于抗體的鑒定是受限的。基于DDA(依賴于數據的采集)的蛋白質組學，因為儀器不能在一個給定的時間足夠快地掃描所有的前體，許多離子，尤其是低豐度離子，無法被MS/MS碎片收集到，因而也無法被檢測到。基于DIA(獨立于數據的采集)的蛋白質組學中，DIA 已經被證實在蛋白質組的定性/定量分析的混合中是有效的。然而，寬的M/Z窗口通常伴隨著DIA引起的前體干擾，相較于使用DDA獲得的數據而言前驅體中選擇性減少了5到10倍。SWATH MS的離子選擇提取取決于兩個標準: 更多高于y3和b3前驅體的碎片離子, 在m/z之間沒有重疊的前體。該數據處理和MRM具有相同的結構,因此，從SWATH 中提取定性以及定量信息的這種做法可能適合用于開發基于MRM-MS檢測新的鑒定方法。

　　訾金還介紹了使用SWATH對食管鱗狀細胞癌生物標志物進行分析；通過MRM鑒定食管鱗癌相關蛋白質；在食管鱗癌血清中鑒定食管鱗癌生物學標志物等。結果表明聯合使用SWATH和MRM的DIA策略有著將蛋白質生物標志物的分析和驗證的耦合、快速、低實驗成本的優點。我們提供了一個清晰的從分析到驗證生物標志物的路徑，用SWATH 檢測294例在混合組織中上調的生物標志物，基于SWATH 數據的基礎上檢測146例合格的生物標志物 146，使用MRM鑒定133例個體組織中的生物標志物，使用MRM鑒定49例個體血清中的生物標志物，以及使用MRM的操作響應檢測13例在個體血清中的生物標志物。血清中的食管鱗癌相關蛋白數據基本上與其他報告一致。

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