LaVision雙光子顯微鏡-多焦點掃描與光激活蛋白在核轉運研究中的應用
Multifocal two-photon laser scanning microscopy combined with photo-activatable GFP for in vivo monitoring of intracellular protein dynamics in real time
Joerg Martini a,1, Katja Schmied b,1, Ralf Palmisano b, Katja Toensing a,
Dario Anselmetti a,¤, Thomas Merkle b
a Department of Experimental Biophysics and Applied Nanoscience, Faculty of Physics, University of Bielefeld, 33615 Bielefeld, Germany
b Department of Genomic Research, Faculty of Biology, University of Bielefeld, 33594 Bielefeld, Germany
Received 11 August 2006; received in revised form 20 December 2006; accepted 21 December 2006
Available online 17 January 2007
Abstract
我們運用多焦點雙光子激光掃描顯微鏡來進行局部和選擇性的蛋白激活以及細胞內蛋白動態的的量化調查。局部激活使用光激活綠色熒光蛋白(pa-GFP)和光學雙光子激發來實現，以調查實時原位的細胞內動態。這個過程對于深入理解和建模活細胞內的調控和代謝過程極其重要。作為范例，既包含了一個核輸入信號又包含了一個核輸出信號的擬南芥MYB轉錄因子LHY/CCA1-like 1 (LCL1)被定量化調查。我們使用了由質粒編碼的光激活綠色熒光蛋白(pa-GFP)融合蛋白和一個紅色熒光轉染標記聯合轉染的煙草BY-2原生質體，并pa-GFPLCL1在核內光激活后的快速向核外輸出。作為對照，一個LCL1核輸出陰性突變體仍然被束縛在核內。我們確定了由激活pa-GFP-LCL1的雙向核運輸和pa-GFP的擴散分別導致的核內熒光下降的51s和125s的平均時間常數
2.材料與方法
2.1.并行的64焦點雙光子激光掃描顯微鏡
Pa-GFP的激活和熒光的原位檢測，通過基于根據蛋白動態監測需求改進的商業化系統(TriM-Scope, LaVision-Biotec; Martini et al., 2005; Nielsen et al., 2001)多焦點2光子LSM檢測(Fig. 1). 64焦點2光子LSM (Martini et al., 2006)包括一個倒置光學顯微鏡和一個可以產生從760nm到960nm的100fs激光脈沖的由固態激光器泵浦的鎖模飛秒Ti:Sa激光器。用于激活和成像循環的波長選則通過一個允許5s內轉換波長的ahome-built screw motorization來實現。
激光掃描單元(TriM-Scope, LaVision-BioTec) 包括一個內置的預啁啾部分以補償激光脈沖的色散，一個光束分光器部分和振鏡掃描器。通過選擇一組10個100%反光鏡和50%分光鏡，激發的NIR激光束在樣品中被分為1, 2, 4,……, 64個激發焦點。這些數目可調的焦點在顯微鏡物鏡(UPLAO60XW3/IR, NAD1.2;Olympus)的焦平面上被激光掃描單元中的2個掃描鏡掃描。整個激活和測量過程在一個溫度可控環境中在293±1K下進行。因為在保持每個焦點的能量沉積低于樣品的退化極限的同時，多個焦點產生了相對高的雙光子誘導熒光產額，成像可以30ms的時間分辨率進行。圖像用一個背照明的EMCCD相機(IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology)以non-descanned方式獲取。激發的NIR激光束被引導通過一個分光鏡 (2光子-Beamsplitter, Chroma)到物鏡的后光圈上。為了成像深度和光譜熒光切片，倒置顯微鏡采用了機械聚焦驅動(MFD, Marzhauser)和一個程序控制濾波輪(LaVision-BioTec)。數據獲取和實驗控制由 TriM Scope的軟件包Imspector(LaVision-BioTec)執行。操作和處理5維的數據列，包括光譜和時間數據軸，使用軟件包Imspector (LaVision-BioTec)，ImageJ (Rasband, 1997) 或 Imaris (Bitplane).
Fig. 1.多焦點2光子激光掃描顯微鏡的原理圖(1) Tsunami Ti:Sa 激光器(波長可調)由固態Millenia X 激光器泵浦 (均來自 Spectra Physics), (2) 多焦點激光掃描單元 (TriM-scope, LaVision BioTec), (3) 分光鏡 (2光子-Beamsplitter, Chroma), (4) 短波通過濾波輪 (2光子-Emitter, Chroma), (5) 物鏡 (UPLAO60XW3/IR, NA D 1.2; Olympus), (6) 樣品中可選擇數目的熒光焦點, (7) 倒置光學顯微鏡(IX 71, Olympus), (8) 濾波輪 (濾波輪, LaVision BioTec)裝備帶通濾波片 D 605/55 (Chroma)用于檢測 Ds-Red 和 HQ525/50 結合 HQ510/20 (均來自 Chroma)以檢測 pa-GFP, (9) 背照式 EMCCD-camera (IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology) 在NDD光路中, (10) 熒光燈 (HBO 50, Zeiss), (11) 帶通激發濾波輪 D 540/25 (Chroma) 用于 Ds-Red 或帶通激發濾波輪HQ 480/20 (Chroma) 用于 pa-GFP.