3. 結果
Fig. 2.含有核輸入輸出信號的擬南芥轉錄因子LCL1 (分別為NLS, NES). 由質粒編碼GFP融合蛋白轉染的煙草BY-2原生質體。通過單光子共聚焦激光掃描顯微鏡分析的GFP融合蛋白穩定態定位。(a) GFP-LCL1 揭示的核與細胞質間的分區
(b) 使用核輸出抑制劑leptomycin B (LMB)孵育后，由于功能性NLS的存在，GFP-LCL1的穩定態分區劇烈轉化為幾乎完全分布于核中。 (c,d) 對照，LMB對單獨的GFP沒有影響。 (e) GFPLCL1(NESm)中，它的NES的點突變造成的LCL1的核輸出活性削弱同樣導致了GFP融合蛋白在核內的聚集。(f) 與(e)中同一個原生質體的透射光與GFP熒光成像的疊加標尺為10um (g) 作為對照的 GFP-NLS 在核內的增加。 (h) 同一原生質體的GFP-NLS綠色熒光蛋白和作為轉染標記的Pra1-DsRed (At2g38360)紅色熒光蛋白的疊加。
Fig. 3. pa-GFP 在一個活原生質體內的自由動態擴散。選出的5幅表達pa-GFP的煙草BY-2原生質體的單光子透射熒光圖像。(a)實驗開始，未激活 (b) pa-GFP的雙光子激活期間 (c–e) 雙光子激活后，所示時間點。(a)核內（紅虛線）的pa-GFP在雙光子激發前平均熒光很難被檢測到。使用4個平行焦點(10mW at 800 nm 每焦點)的持續3s的飛秒激光對一個7X8um的區域進行pa-GFP 2光子激發開始 (b) 激發后很短時間內檢測到一個強的熒光信號(c–e) pa-GFP從核內向細胞質的擴散被監測，直到兩組分間達到平衡。熒光強度標尺顯示在每幅圖的左邊。
Fig. 4.在核內被光激活后，pa-GFP從核內向細胞質擴散的量化分析。在激活前，核內（ROI）平均的1光子熒光強度非常低（平均強度～300）.在26s和29s間的時間點，由飛秒激光激活誘導的熒光增強在圖上進行了監測。 與光激活前相比，平均熒光強度是之前的大約5倍，伴隨著ROI內的熒光降低。在第一個地方，監測到的細胞核內熒光下降是由于激活的pa-GFP向細胞質內的擴散。后來，光漂白變得顯著。雙指數擬合非常近似地擬合了整個熒光下降過程（紅線）。以此方式計算出這個實驗中175s的擴算時間常數。