Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration
Panteleimon Rompolas1, Elizabeth R. Deschene1*, Giovanni Zito1*, David G. Gonzalez2, Ichiko Saotome1, Ann M. Haberman2& Valentina Greco1
1Department of Genetics, Department of Dermatology, Yale Stem Cell Center, Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut 06510, USA.
2Department of Laboratory Medicine, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut 06510, USA.
摘要 組織的發生與再生依賴于細胞-細胞間相互作用和指向干細胞的信號以及它們的直接增殖。但是，引導組織適當再生的細胞行為還沒有被很好的理解。運用一種新的，非侵入的雙光子成像技術，我們研究了活鼠隨時間推移的生理性毛囊再生。通過這種方法，我們監測了真皮層干細胞和它們的后代在生理性毛囊再生過程中的行為，并指出了間充質對它們行為的影響。承接早先的研究，干細胞在毛發再生的初始階段處于靜止狀態而它們的后代處于更活躍的分生狀態。除了細胞分化之外，后代細胞的協調運動也允許毛囊的快速擴張。最后，我們通過切蝕目標細胞的和長時間跟蹤活毛囊展示了間充質對毛發再生的要求。因此，我們建立了一種直接原位觀察毛囊內生長調控的細胞機制的方法，這使得我們可以精確調查生理性再生過程對毛囊組分的功能性要求。
材料與方法
在原位成像中，對3周齡的小鼠通過腹膜內注射克他命和甲苯噻嗪進行麻醉，頭部區域的皮膚使用機械剪毛器和脫毛膏剃光。小鼠被放在一個加熱平臺上，頭部和耳朵通過一個自制固定臺固定。一個玻璃蓋被放在頭耳結合部的皮膚上。皮膚的圖像棧通過一臺裝配Chameleon Vision II (Coherent)雙光子激光器的LaVision TriM II Scope（LaVision Biotech產品）顯微鏡獲取。一束激光(at 940 nm for GFP and 1040 nm for RFP, respectively)通過aX20水浸物鏡（(N.A. 1.0; Olympus)聚焦并以600Hz的頻率掃描0.25到0.5mm2的視野區域。系列光學切片在5分鐘內以步長2-3μm成像總深度100μm的組織。從靜止階段向生長階段轉變的幾個相（靜止相到生長初期相）被分析。在皮膚里使用不同的內在標記以在不同試驗中定位到視野的初始區域并觀察同一個毛囊。實驗過程中通過鼻尖吸入氣化異氟醚保持麻醉狀態。
三維雙光子激光切蝕。使用同樣的光學設備進行激光切蝕。使用900nm的激光束掃描一個10μm2的區域，以25%的激光能量持續1秒鐘即可獲得切蝕。根據目標深度(30–80 μm)調整切蝕參數。
主要結果
Figure 1 | 新的一次生長開始，細胞分化是在毛囊中進行空間調控的。a,靜止狀態毛囊。參與毛發再生的不同細胞群，包括干細胞，progeny和間充質，存在于定義的毛囊解剖隔層中。 b, 來源于雙光子激光掃描顯微鏡系列光學切片的靜止態活毛囊的三維重構。上皮細胞核（綠色）通過角蛋白14啟動子(K14H2BGFP)驅動的H2B-GFP融合蛋白顯影。 c, 一個progeny 分裂的例子。一個活毛囊的單獨光學切片（左側）和progeny 組分中三個處于有絲分裂期間細胞核的放大圖（右側，插圖）。 d, 從幾個處于早期生長階段毛囊(n=17)中定量化細胞分裂的位置和軸 (生長初期 II)。e,垂直（左圖）和水平（右圖）方向干細胞分裂的兩個例子。一個活毛囊的單獨的光學切片（左側插圖）和處于有絲分裂中的干細胞隔層（右側插圖）的細胞核放大圖。紅色箭頭，有絲分裂中的親代核與子代核。圖片的時間推移分別為15分鐘和45分鐘。標尺20 μm.