LexA酵母雙雜交系統的設計原理

LexA酵母雙雜交系統的設計原理

報告質粒p8op-LacZ的GAL4 UAS編碼序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活劑的情況下，報告基因LacZ的轉錄活性為零，該基因的篩選標志為URA3，可以作為有自主復制能力的質粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。

質粒pLexA的篩選標志為HIS3，在雙雜交系統中用于表達DNA-BD（202個氨基酸殘基組成的LexA蛋白）與目標蛋白（釣餌，Bait）的融合蛋白，該融合體的表達受酵母強啟動子ADH1的調控，選擇與報告基因的操縱子LexA×8結合。

質粒pB42AD的篩選標志為TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位點（EcoR I與Xho I）上游，含有SV40核定位（SV40 nuclear localization）、HA（血凝素）及AD（來自于E.coli的88個氨基酸殘基組成的B42蛋白）等幾種編碼序列，共同組成可以啟動報告基因轉錄表達的激活成份。

在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個報告基因Leu，它與LacZ報告基因具有相同的操縱子-LexA，但兩者啟動子不同。

根據雙雜交系統的原理，如果某一復合物同時具有DNA-BD和AD的活性，即可激活報告基因的轉錄和表達。分別將待測蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質粒載體和pB42AD質粒載體的多克隆位點中，然后共同轉入含有報告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能相互作用，則啟動報告基因的轉錄和表達，通過檢測報告基因的表達情況，就可以間接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強弱。

如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫，則可用X從該文庫中篩選出能與其相互作用的蛋白，并且可以獲得編碼這些蛋白的cDNA。