前言：
近年來，異常RNA修飾與腫瘤發生的關系引起了廣泛關注。作為一種廣泛存在的修飾，DNA和RNA中的5-甲基胞嘧啶(m5C)已被發現數十年。DNA
m5C修飾在腫瘤發生中的作用已被廣泛研究。然而，關于RNA
m5C修飾在腫瘤發生中的作用知之甚少。NSUN2是哺乳動物中主要的m5C修飾甲基轉移酶之一，在RNA代謝過程中起重要作用。近期，云序客戶在一項研究中通過云序提供的轉錄組測序結合m5C-Bis-Seq測序的方法，首次發現H19 LncRNA是NSUN2 RNA甲基修飾酶的特異靶點。該結果幫助我們更深的理解RNA生物學和人類疾病中m5C RNA甲基化的功能，同時可為肝癌的診斷和治療提供潛在的靶點和生物標志物。
發表期刊：Oncogene
影響因子：8
研究方法：m5C-Bis-Seq測序，全轉錄組測序，RNA pull down+質譜分析，蛋白免疫沉淀
文章鏈接：Aberrant NSUN2-mediated m5C modification of H19 LncRNA is associated with poor differentiation of hepatocellular carcinoma
研究內容：
（1）NSUN2缺失細胞構建和NSUN2功能研究
為了探討NSUN2在肝細胞癌（HepG2）中的功能作用，首先通過基因敲除構建NSUN2缺失的HepG2細胞，以此與野生肝癌細胞對比。通過RT-qPCR和western
blot等反應評估得出，細胞超過90%的NSUN2的基因表達受到抑制，證明缺失株構建成功。
體外生長試驗也發現NSUN2基因缺失細胞生存力和細胞克隆能力顯著降低；用流式細胞儀分析細胞周期分布發現與野生型細胞相比，NSUN2缺陷型肝癌細胞少量處在G1和S期，更多處于G2和M期，說明缺失NSUN2基因HepG2細胞增殖與分裂受到抑制。
圖1
進一步采用傷口愈合試驗和Trans-well侵襲試驗發現NSUS 2基因缺失導致細胞遷移和增殖能力受限。用肝癌細胞接種裸鼠也發現，接種NSUS 2缺失細胞形成的腫瘤明顯小于接種野生型肝癌細胞形成的腫瘤。這些結果與體外結果一致，進一步證實了NSUN2在肝癌細胞的致瘤性中起重要作用。
圖2
（2）NSUN2基因缺失細胞RNA表達和m5C修飾表達譜
基于NSUN2缺失后細胞表型的改變，為進一步探索其分子層面的變化，對野生型HepG2和NSUN2缺陷型HepG2進行轉錄組測序和m5C-Bis-Seq測序。RNA-Seq測序結果分析發現2681個差異表達基因，富集途徑大多數與致癌作用有關，包括癌癥過程、Rap1信號途徑、PI3K-Akt信號途徑、癌癥中的蛋白聚糖和TGF-β信號途徑(圖3c)。m5C-Bis-Seq總共鑒定出1208個基因中11788個m5C候選位點在HepG2和NSUN2缺失細胞之間有差異甲基化。KEGG富集分析顯示這些DMGs在20種途徑中富集，包括剪接體、癌癥中的蛋白聚糖、細胞周期、雌激素信號通路等（圖3e）。RNA-Seq與m5C-Bis-Seq比較分析后得出，NSUN2缺失，導致包括H19 LncRNA在內的52個lncRNA在m5C甲基化和lncRNA表達方面都有顯著變化。
圖3
（3）H19 LncRNA是NSUN2的底物
NSUN2缺失后，RT-qPCR驗證發現H19的表達下調了至少80%，H19特異性引物的Bisulfite-PCR檢測發現H19 RNA
C986位點甲基化完全喪失。而NSUN2的重新表達在一定程度上恢復了H19 LncRNA在NSUN2缺陷型肝癌細胞中的表達和甲基化。
圖4
（4）m5C修飾影響H19 RNA的半衰期與穩定性
為進一步驗證NSUN2介導H19 LncRNA甲基化是否會影響H19 LncRNA表達水平。研究者使肝癌細胞接受ActD
處理，然后進行RT-qPCR分析H19 RNA半衰期。如圖5a所示，H19
RNA的半衰期在NSUN2缺失后顯著縮短。此外，在NSUN2缺陷的HepG2細胞中，NSUN2的重新表達在一定程度上恢復了H19
RNA的半衰期(圖5b)。與此同時陰性對照顯示NSUN2的缺失或重新表達不影響ACT-B基因的半衰期。
此外，m5C位點在調節H19穩定性是使用熒光素酶報告分析來驗證的，該分析通過構建含有野生型H19基因片段（H19-Wt）和具有突變m5C位點H19基因片段（H19Mut）的細胞來實現的。不出所料，m5C位點突變顯著抑制正常肝癌細胞的熒光素酶活性，但不抑制NSUN2缺陷肝癌細胞的熒光素酶活性(圖5c)。H19-Wt的熒光素酶活性在正常HepG2細胞中顯著高于NSUN2缺陷型HepG2細胞。因此，這些結果表明NSUN2介導的RNA甲基化可能使H19
LncRNA穩定。
（5）H19表達和m5C修飾與HCC分化有關
接下來，作者測定了55名HCC患者的HCC組織及其癌旁正常組織中H19
RNA的表達和甲基化水平。與癌旁組織相比，H19在HCC組織中的表達顯著增加，H19 C986位點的甲基化水平明顯升高，此外，H19
RNA水平與其在這些組織中的RNA甲基化水平顯著相關(p< 0.01，r= 0.511)(圖5f)。
然而在HCC組織和癌旁組織之間，NSUN2 mRNA水平沒有顯著變化組織(圖5g)。當與H19
C986甲基化水平差異超過10%的組織進行比較時，HCC組織中的NSUN2 mRNA水平顯著高于癌旁組織(圖5h)。表明NSUN2介導的H19
LncRNA的m5C異常修飾與腫瘤分化程度相關。綜上所述，我們的發現表明H19的RNA甲基化水平在HCC增加，并與其表達呈正相關，這與惡性HCC病顯著相關。
圖5
（6）NSUN2介導m5C修飾的H19 LncRNA與癌蛋白G3BP1相互作用
XIST和HOTAIR LncRNAs m5C修飾被證明能調節它們與PRC2的相互作用。
因此，作者猜測m5C修飾的H19 LncRNA可能調節其與其他蛋白質的相互作用。通過使用RNA pulldown-MS技術（云序可提供），分離鑒定到與H19
LncRNA結合蛋白G3BP1。由H19 RNA探針下拉的G3BP1在野生型HepG2細胞中可檢測到，但在NSUS
2缺陷型HepG2細胞中檢測不到，同時，在野生型HepG2細胞和NSUS
2缺陷型HepG2細胞之間的G3BP1蛋白水平沒有顯著變化(圖6b)，表明H19 RNA和G3BP1蛋白之間的相互作用可能受到NSUS
2的影響。使用G3BP1抗體的RNA結合蛋白免疫沉淀RIP-PCR（云序可提供）證實了這一概念(圖6c)。G3BP1在野生型HepG2細胞中特異性結合H19
LncRNA，而在NSUS 2缺陷型HepG2細胞中不結合，這一事實表明H19 LncRNA與G3BP1蛋白的相互作用可能依賴于NSUS
2介導的RNA甲基化。用純化的重組人G3BP1蛋白和H19
RNA探針進行了進一步的rEMSA實驗。結果顯示G3BP1重組蛋白優先結合m5C修飾的寡核苷酸(圖6d)，表明G3BP1蛋白和H19
RNA結合受m5C修飾調控。
圖6
點評：
文章通過m5C-Bis-Seq結合全轉錄組測序技術（云序提供），通過對測序結果比對分析篩選到差異的m5C修飾的差異RNA，該方法的優點是兩個測序結果取交集縮小差異范圍，明確科研檢測目標。另外m5C-MeRIP結合RNA pull down實驗（云序可提供），正反向驗證與RNA特異性結合的蛋白，對深度挖掘不同分子的RNA修飾機制提供可靠的依據。