中國最早從事多重流式熒光試劑開發的企業透景生命于2017年在創業板成功上市。在此之后，越來越多的企業和投資機構開始聚焦這一領域。這一領域的新興企業，比如芯凱瑞、譜迪生物紛紛受到投資機構的青睞；中翰盛泰、東方生物等企業也在這一領域不斷投入；美國多重流式熒光試劑生產企業Zeus也在常州設立工廠，開始了國產化的步伐；在國內，部分有前瞻性的投資公司開始布局多重流式熒光賽道；流式細胞儀領域的不少創業公司，比如唯公科技、指真生物也紛紛“跨界”進入這一領域。有分析報告指出，多重流式熒光檢測是暨化學發光之后，IVD行業內最受矚目的細分領域之一。
2021年4月，美國多重流式熒光檢測的領軍企業Luminex公司被意大利DiaSorin公司以18億美金價格收購，又引起了資本界及產業界對多重檢測的新一輪熱議。筆者近年來一直高度關注這一領域，也對Luminex的產品布局及產品管線很感興趣，正好做一下分享。
一、Luminex的誕生：朋友、家人和Taco
Luminex公司于1995年在德克薩斯州首府奧斯汀市成立。公司的三個主要創始人均是來自于德克薩斯大學西南醫學中心（UTSW Med Center）的三位免疫學高材生，分別是Mark、Ralph和Jerry。此外，還有Mark的哥哥Van，一名計算機科學家，以及一名化學家唐先生。
創建Luminex公司的想法來自于前一年的一次Taco餐。1994年，在達拉斯的一家墨西哥餐廳Escondido，來自UTSW Med Center的流式細胞術教授Jack Kettman介紹了他的新想法，使用流式細胞術對不同粒徑的微球進行分析，從而能對不同的生物學指標進行多重檢測。Van則建議可以使用不同顏色的微球進行編碼，作為計算機科學家的他可以編輯出針對多色微球分析的算法。因此，Luminex在微球技術路線的選擇上，從一開始就專注于多色編碼微球這條技術路徑。
從創世團隊的組成可以看出，Luminex這家公司的能力拼圖涉及到材料化學、免疫學、計算機科學及儀器硬件，這也決定Luminex這家公司的技術高度。
二、Luminex的微球技術
Luminex確定了微球的技術路線之后，在微球設計階段，唐先生發現了一個問題，如果使用粒徑較小的微球，如1-2μm粒徑的微球，則很難包裹住足夠數量的熒光染料，為了讓微球有更好的分群效果，Luminex一開始就選擇了大粒徑的聚苯乙烯微球。
最開始的微球驗證工作是在BD公司的FACScan流式細胞儀上進行的，通過在流式細胞儀上增加了一塊電路板，Van寫的軟件可以修改FACScan上的參數設置，同時接收微球發出的信號。
經過多年研發，Luminex公司在微球開發及生產上也形成了穩定的工藝。先后開發出了多種微球，其中最具代表性的是MicroPlex聚苯乙烯微球（圖1右邊的微球）及MagPlex磁性微球（圖1左邊的微球）。目前在IVD應用更為廣泛的是MagPlex磁性微球。磁性微球的應用，使得樣本的前處理更易于實現自動化。而傳統的聚苯乙烯微球，則需要抽濾的方式進行清洗及樣本前處理。
圖1 Luminex微球示意圖
在編碼微球的重數上，Luminex目前通過2種或3種不同的染料，這些染料具有相同激發光波長，但發射光波長不同，因此很容易被區分開。另外，通過調整不同熒光染料的比例，可以形成100重（10*10）或500重（10*10*5）的微球矩陣，可以對幾百個不同指標同時進行檢測，極大的提高了檢測通量。
圖2 Luminex微球重數及光譜示意圖
為了保證微球的均一性，Luminex微球的生產工藝也是比較復雜。以MicroPlex微球為例，簡單來說可以分為兩步。第一步是微球的制備，第二步是微球的染色。微球制備的步驟，首先通過分散聚合來制備種子微球，種子微球普遍粒徑較小，一般為2μm左右。之后加入苯乙烯、表面活性劑及其余物質，使得微球粒徑膨脹到6μm左右。最后在聚合作用下，形成最終的聚苯乙烯微球。接下來就是微球的染色，此時微球是多孔滲透結構的，可以繼續溶脹將染料及第一種溶劑吸收進微球，但由于微球存在交聯結構，也使得微球不會過度溶脹。在微球吸收了染料及第一種溶劑后，再向反應體系中加入第二種溶劑，第二種溶劑可以將第一種溶劑從微球內部擠出，并將微球回縮到預期的粒徑（5.6μm或6.5μm）。
三、Luminex的儀器平臺
在不斷升級優化微球技術的同時，Luminex同時也進行儀器的開發。
1. FlowMetrix系統
FlowMetrix系統是Luminex推出的第一款多重檢測平臺，其是以BD公司FACScan流式細胞儀為基礎，做了部分優化而來的。這個檢測系統包含一臺FACScan流式細胞儀、一臺個人電腦、一張數據信號處理卡以及一個基于Windows 95系統開發的軟件。FACScan是一臺單激光（488nm）三色（綠色530nm、橙色585nm和紅色＞650nm）流式細胞儀，可同時對64種微球進行分析。橙色熒光通道F2/紅色熒光通道F3用于微球的分類，綠色熒光通道F1用于報告熒光的檢測，即待測物濃度分析。一張數據信號處理卡連接了FACScan流式細胞儀和個人電腦，用于將流式細胞儀上產生的數據高速傳輸到電腦上。電腦上的軟件分為了兩種模式，分別是“Multiplexed mode”和“data acquisition mode”，前者是自動對多重檢測結果進行分析，后者則是需要手工設門及分析。
圖3 在FlowMetrix系統上顯示的64重微球
FlowMetrix系統的一大劣勢是需要調節報告熒光F1與分類熒光F2/F3的之間的補償，這也影響了FlowMetrix系統的推廣及使用。
2. Luminex 100/200系統
Luminex團隊很快發現了問題，在20世紀90年代，擁有流式細胞儀的實驗室非常少，這也限制了多重檢測技術的進一步推廣應用。在流式細胞儀的教父之一，Howard Shapiro的推薦下（相信不少流式領域的從業者都讀過他寫的書《Practical Flow Cytometry》），Luminex團隊開始進行儀器的研發，并于1999年推出了真正意義上的第一代多重檢測平臺Luminex 100，同時Luminex的微球團隊也將微球重數從64重升級到了100重，因此Luminex 100這臺機器能同時對100種生物標志物進行檢測。特別值得一提的是，有幾位華人科學家也參與了Luminex微球的優化過程。
Luminex 100這臺機器包含兩種激光器，分別是532nm、13-mW的釔鋁石榴石（YAG）激光器，用于激發二抗/檢測抗體上標記的藻紅蛋白（PE），其發射波長為578nm；以及635nm、10-mW的紅色二極管激光器，用于激發微球內部的兩種熒光，這兩種熒光的發射光波長分別是658nm和712nm，與藻紅蛋白的發射光波長沒有重疊，也徹底解決了困擾FlowMetrix系統的補償問題。
圖4 Luminex 100及其核心技術
Luminex 100的檢測原理被業內廣泛熟知，Luminex支持96孔板上樣，被加樣針吸上來的樣本在鞘流液的包裹之下，形成單個微球的隊列依次、快速通過檢測部分。635nm、10-mW的紅色二極管激光器，激發微球內部染料中的兩種熒光物質發射出相應的兩束發射光被兩個雪崩光電二極管接收。而側向角散射光是用于設門區分單一編碼微球和氣泡、雜質等干擾信號。532nm、13-mW的釔鋁石榴石（YAG）激光器，激發二抗/檢測抗體上標記的藻紅蛋白，藻紅蛋白發射的熒光被光電倍增管接收。高速的數字信號處理器分析微球發出的兩束發射光后，將微球進行準確定位及編號，同時定量藻紅蛋白發出的熒光信號，計算出待測物的濃度。
圖5 Luminex檢測原理示意圖
通常來講，每種微球至少要讀取100個，計算其中位值，這樣才能最大程度減少96孔板讀取過程中的延滯效應。
2005年，Luminex 100的升級版Luminex 200上市。相對于Luminex 100，Luminex 200 的主要優點是操作者可根據需要調節探針高度，運用Luminex XY 板操縱平臺增強了檢測準確性，提高了空氣壓縮機的性能使系統運行更加安靜以及日常維護更加方便等。Luminex 200也是目前最為廣泛應用的多重檢測平臺，不論是在科研領域還是IVD領域。
3. FLEXMAP 3D系統
Luminex公司也在持續不斷地優化微球和檢測平臺，在2009年上市了能同時檢測500重微球的FLEXMAP 3D系統。除了檢測重數增加之外，FLEXMAP 3D系統還做了諸多優化和升級。首先，機器不僅能夠兼容96孔板，還可以兼容384孔板，檢測通量更大。其次，首創的雙進樣系統可以最大程度提升分析速度，96孔板分析時間僅需要20min，相對于Luminex 200分析速度提高2—3倍，384孔板的分析時間也只需要75min。第三，配套開發的xPONENT軟件不僅可以操作FLEXMAP 3D系統，并提供了實驗室信息系統（LIS）和前端自動化平臺的接口選項，有利于Luminex機器與自動化移液工作站的連接。
4. MAGPIX系統
Luminex平臺在上市后，市場反饋良好，而且越來越多的公司及實驗室基于這項技術進行試劑的開發及科研工作。但是其昂貴的機器成本，也使得一些實驗室望而卻步。為了解決這一問題，Luminex的第三代檢測平臺MAGPIX放棄了成本昂貴的流式平臺，轉為改為成本較為低廉的拍照平臺。MAGPIX平臺核心技術基于流通池及CCD成像原理，微球經過流通池被送入拍照室內，紅色LED（630nm）激發微球內的兩種熒光染料，綠色LED（515-521nm）激發蛋白上標記的報告熒光分子，通過CCD成像記錄微球的位置及報告熒光分子的強度，對待測物進行分析。
圖6 MAGPIX檢測原理
不同于流式技術每個微球進行單獨檢測，MAGPIX平臺一次可以對所有微球進行檢測及分析，雖然分析速度略有提升，但是嚴重犧牲了檢測性能。從分析重數就可以看出，MAGPIX一次理論上最多只能分析50種不同指標，相對Luminex 200可同時分析100種指標，還是有較大的差距。即使其成本相對于Luminex 200有了較大的下調，感興趣者依然寥寥無幾，也沒有什么IVD合作伙伴愿意基于這項技術進行試劑的開發。類似的拍照技術也被一些中小公司采用，但是受制于其性能本身，始終無法成為多重檢測的主流技術。
5. xMAP INTELLIFLEX系統
在2020年，也就是Luminex公司成立25年的時候，Luminex上市其新一代多重檢測xMAP INTELLIFLEX系統，該平臺與FLEXMAP 3D系統一樣可以同時對500種微球進行分析。另外，其新增加了第二個報告激光通道，在傳統532nm激光外，還新增了第二個報告激光405nm，其對應的檢測器為421—441nm。這也意味著，可以對同一個微球上的兩個不同待測指標進行同時分析，進一步提高了檢測效率。從用戶操作角度，xMAP INTELLIFLEX系統第一次采用了觸摸屏，無需外接電腦，使得操作更加簡便，也同時節約了實驗室的空間。這個目前只是在科研領域使用，還尚未進入IVD市場。
圖7 雙報告通道及單報告通道示意圖
下面是對上述Luminex不同平臺的匯總及對比。
圖8 Luminex現有多重平臺匯總及對比
四、筆者澤楷分析
4.1 多重流式熒光技術能解決中國IVD市場的諸多痛點
筆者曾經跟醫學檢驗領域諸多大咖，進行深度交流：專家均覺得多重流式熒光技術是一項被低估且尚未完全發揮其全部價值的技術，其邏輯在于成本低、通量高、靈活組合；在當前檢驗科樣本量不斷攀升且醫保控費越來越嚴格的大環境，高通量且低成本的多重流式熒光技術必然會大放異彩。該系統開發難度也確實大于其他平臺，具體體現在相關企業要掌握核心編碼微球技術、流式熒光檢測模塊與全自動儀器的開發及兼容、試劑的開發及項目的組合等諸多核心能力。
而認為多重檢測是重復收費、捆綁檢測的論斷，其實是沒有掌握多重流式熒光技術的本質，那就是可以靈活組合檢測指標，并不一味是大組合；多重檢測和化學發光可以很好的結合在一起服務于醫學實驗室。
一項技術能否成功，除了商業推廣之外，本質在于能否為醫學實驗室和患者帶來價值，也就是多快好省的解決實驗。全自動多重流式熒光技術，能夠在檢驗收費紅利逐漸散去之后，在收費下調、集中采購等控費手段的政策壓力下，綜合降低每檢測結果的成本，就是cost/result, 而不是cost/test，這也符合中國醫改的大方向。
4.2 必須突破卡脖子技術
說到這里，筆者不禁想說：縱使多重流式熒光檢測技術是劃時代的技術，但Luminex總部的商業策略也限制了這一技術被更多的合作伙伴及客戶所接受。筆者的德國同事早在十多年前，就在預研基于Luminex平臺的相關檢測產品，認為這是一項偉大的技術，而高昂ZL使用費和后續嚴格的采購壓力，令諸多企業不能持續在這個領域探索。筆者梳理了Luminex目前在中國地區的商業合作伙伴（見表1），大部分企業與Luminex的合作并沒有達到預期的效果或者中途停止，其中的辛酸苦辣只有各位中國企業的當事人才最清楚。
圖1 Luminex在中國大陸地區的商業合作伙伴
然而縱觀現代科技史，在工業社會和互聯網時代，一項偉大的技術不會因為人為壁壘和技術封鎖而被中國人輕易放棄，不少國內企業魚貫入場，努力攻克國外“卡脖子”技術，底層邏輯仍然是看到應用的潛力和顛覆戰局的可能。
4.3 自動化解決方案
在中國，醫學實驗室用戶的使用習慣在過去二十年已經被廣泛的影響。在自動化解決方案領域，尤其是針對IVD客戶的自動化解決方案，Luminex一直沒有任何布局，都是Luminex的商業合作伙伴自行尋找解決方案，有的企業將Luminex 200與某些ELISA前處理站整合，有的企業與儀器設備提供商合作開發前處理管式設備。在中國市場，沒有自動化解決方案，在檢驗科基本上是寸步難行，這塊也是不少企業難以邁過去的坎兒。
4.4 李逵和李鬼
筆者在前文也提到了拍照技術相對于多重檢測的經典流式技術，在成本上有了明顯的下降，但是檢測性能、拍照時的彼此干擾都對檢測結果造成很大的影響，這也是多重檢測領域的拍照技術被國內外IVD企業普遍拒絕的主要原因。
無論是化學發光，還是多重流式熒光技術，都不約而同地選擇了微球做為固相載體，其原因是微球的比表面積較大，上面能包被更多的基團，用于偶聯相關的抗原抗體，這也是保證試劑良好線性范圍的基礎。此外，磁性微球的磁吸附及分散效果非常好，使得清洗更加徹底，最大程度避免因清洗原因導致的結果異常。
但是一項由臺灣人在上世紀發明、且沉寂了多年的技術，被部分企業引入國內，也被冠以“數碼液相芯片”等概念。有業內同仁指出，這項技術的本質就是酶免前處理平臺、微孔板條式反應設計、磁條二維碼載體及相機拍照檢測的混合體，其與經典的多重流式熒光技術相距甚遠。至于整個體系的表現和結果，可參考板式化學發光技術在發光賽道的表現。CAP報告顯示，約55%的美國實驗室采用多重流式熒光技術進行自身抗體檢測，而無一家實驗室在過去二十多年使用這種磁條二維碼技術。不少國內外的檢驗界專家也對這項技術能否在IVD領域應用表示懷疑。
五、后記
圍繞著Luminex這家頗具傳奇經歷的企業和多重流式熒光檢測技術，我相信還有很多話題可以展開討論，筆者也計劃圍繞相關議題多寫一些文章，與行業內的各位同仁交流探討，包括：1. Luminex營收分析；2. Luminex圍繞分子診斷線的產品布局；3. Luminex的收購邏輯梳理；4. 多重流式熒光技術在免疫診斷及分子診斷的最佳應用領域等等，也歡迎大家分享出你對Luminex這家公司或者這項技術感興趣的話題。
筆者所在的公司多年來一直在多重流式熒光這一領域埋頭研發，目前已經解決多重檢測的諸多核心技術難題，同時也很欣慰的看到產業界及投資界諸多同仁對這一技術高漲的熱情，也希望能攜手推動這項技術的進一步普及。
