M13噬菌體雙鏈（復制型）DNA的制備

限制性內切核酸酶 大腸桿菌培養物

堿裂解液 乙醇 酚 氯仿 TE

瓊脂糖凝膠

一、材料

1. 緩沖液和溶液

堿裂解液Ⅰ

堿裂解液Ⅱ

堿性裂解液Ⅲ

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V）

含 20 μg/ml Rnase A 的 TE ( pH 8.0)。

2. 酶和緩沖液

限制性內切核酸酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠（0.8%) 懸于 0.5 X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠

4. 載體和菌株

感染了 M13 噬菌體的大腸桿菌培養物

二、方法

感染細胞的裂解

1. 在微量離心機上，將 1 ml M13 感染細胞培養物以最大轉速室溫離心 5 min，從培養液中分離感染細胞。將上清轉移至新的微量離心管，存于 4℃，感染細胞沉淀置于冰上。

2. 細胞沉淀 4℃ 離心 5 s，用自動移液器吸去殘余培養液。

3. 加入 100 μl 預冰冷的堿裂解液Ⅰ，劇烈振蕩，以懸起細胞沉淀。

4. 在管中加入 200 μl 新配置的堿裂解液Ⅱ。蓋緊蓋子，快速顛倒混合 5 次。不要振蕩。混合后置于冰上 2 min。

5. 在管中加入 150 μl 冰冷的堿裂解液Ⅲ。蓋緊蓋子，顛倒混合數次，使堿裂解液Ⅲ與黏稠的細菌裂解物混合，置于冰上 3~5 min。

6. 在微量離心機上，將細菌裂解物以最大轉速 4℃ 離心 5 min，將上清轉移至新的微量離心管。

M13 噬菌體 RF DNA 的純化

7. 加入等體積酚：氯仿。振蕩混合有機相和水相，以最大轉速離心 2~5 min 將水相 (上相）轉移至新的微量離心管。

8. 加入 2 倍體積的乙醇沉淀雙鏈 DNA。振蕩混合，室溫放置 2 min。

9. 在微量離心機上，以最大轉速 4℃ 離心 5 min 回收 DNA。

10. 輕輕吸去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使管內液體流盡，除去吸附于管壁上的任何液滴。



11. 加入 1 ml 70% 乙醇 4℃ 離心 2 min，按步驟 10 的方法去除上清，核酸沉淀室溫干燥 10 min。

12. 為了去除微量 RNA，沉淀用含 RNase 的 TE（pH 8.0）重懸，略加振蕩。

13. 用適當的限制性內切核酸酶消化并用瓊脂糖凝膠電泳分析雙鏈 RF DNA。