| 實驗步驟 |
一、材料
1. 緩沖液和溶液
ATP (10 mmol/L)
乙醇
IPTG ( 20%, m/V)
酚: 氯仿（1:1, V/V)
乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
X-gal (2%, m/V)
2. 酶和緩沖液
噬菌體 T4 DNA 連接酶
限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠（0.8%) 懸于 1 X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
4. 核酸和寡核苷酸
外源 DNA
測試 DNA
5. 培養基
YT 或 LB 瓊脂平板
YT 或 LB 培養基
YT 或 LB 上層瓊脂或瓊脂糖
6. 專用設備
培養管（5 ml 或 15 ml, 如 Falcon 2054 或 2006, Becton Dickinson), 預冷至 0℃
加熱器，調至 47℃
冰浴
水浴，調至 12~16℃ 和 42℃
7. 載體和菌株
M13 噬菌體載體 DNA (RF)
帶有 F' 質粒的適當大腸桿菌菌株的感受態細胞
大腸桿菌 F' 鋪板菌體
二、方法
載體 DNA 的制備
1. 用 3~5 倍過量的適當限制酶完全消化 1~2 μg M13 噬菌體 RF DNA，設立一個含 M13 RF DNA 而無限制酶的對照。
2. 溫育將結束時，每個反應管取少量 DNA 樣品（50 ng), 用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分析消化程度。如果消化不完全（如還有可見的閉合環狀 DNA), 加入更多的限制酶并繼續溫育。
M13 RF DNA 制品可能含有一定量的單鏈 M13 DNA, 這些 DNA 在瓊脂糖凝膠電泳時呈遷移較快的模糊條帶，由于單鏈 DNA 不能被絕大多數限制酶所切割，因而在對照和樣品中這些帶應一致。
3. 消化完全后，酚: 氯仿抽提，然后在 0.3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2)存在下，用標準的乙醇沉淀方法純化 M13 DNA。然后將 DNA 以50 μg/ml 的濃度溶于 TE ( pH 8.0)。
4. 如果需要，用小牛堿性磷酸酶或蝦堿性磷酸酶處理，使線狀載體 DNA 脫磷酸。脫磷酸反應結束后，用加熱或用蛋白酶 K 消化使堿性磷酸酶失活，然后再用酚：氯仿抽提。
5. 用步驟 3 的方法回收線狀 M13 DNA。將脫磷酸的 DNA 以濃度為 50 μg/ml 溶于 TE ( pH 7.6)。
用于克隆的外源 DNA 的制備
6. 獨立的外源 DNA 限制性片段可通過適當的限制酶切和瓊脂糖凝膠電泳純化得到。制備的外源 DNA 以濃度為 50 μg/ml 溶于 TE (pH 7.6)。
連接
連接互補的黏性末端時，請按以下步驟 7~9。建立平末端連接反應，請看方案“在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗”。
7. 在一個微量離心管（管 A ) 中，將約 50 ng 載體 DNA 和摩爾數 1~5 倍過量的目標 (外源）DNA 混合，混合體積不超過 8 μl。如果需要，加入 TE ( pH 7.6 ) 將體積調整至 7.5~8.0 μl。設立以下對照：
8. 在所有四個反應管中（管 A~D) 各加入 1 μl 10X 連接緩沖液和 1 μl 10 mmol/L ATP。
9. 在管 A、B 和 D 中各加入 0.5 Weiss 單位噬菌體 T4 DNA 連接酶。各管輕拍管壁數秒混合內容物。12~16℃ 連接反應 4~16 h。
轉化
10. 用 YT 或 LB 培養基，37℃ 持續振蕩制備過夜培養的鋪板菌體。
11. 從 -70℃ 冰箱取一支帶有 F' 質粒的所需菌株的感受態細胞，室溫融化，置于冰上 10 min。
12. 在 16 支預冷至 0℃ 的 5 ml 無菌培養管（Falcon 2054, Becton Dickinson) 中各加入 50~100 μl 的 F' 細菌感受態細胞。
13.
立刻在含有感受態細胞的各培養管中分別加入連接反應產物和對照（管 A~D ) 各 0.1、1.0 和 5 μl。輕拍管壁數秒混合細菌和
DNA。冰上放置 30~40 min。另設兩個轉化對照，一個含 5 pg M13 噬菌體 RF DNA, 另一個不加 DNA。
14. 在連接的 DNA 與感受態細胞溫育的同時，準備 16 支備含 3 ml 融化的 YT 或 LB 上層瓊脂的無菌培養管，置于 47℃ 加熱器或水浴上，直至步驟 16。
15. 將含有感受態細菌和 DNA 的培養管移至 42℃ 水浴，溫育，立刻將培養管移回冰水浴。
轉化細胞鋪板
16.
在步驟 14 準備的含融化的上層瓊脂的培養管中加入 40 μl 2% X-gal, 4 μl 20% IPTG 和 200 μl
過夜培養的大腸桿菌細胞（步驟 10), 溫和振蕩數秒混合內容物。
將各轉化細胞分別加入各培養管中，加蓋溫和顛倒三次，依次將備管中的內容物倒至作好標記的 LB 瓊脂平板，轉動平板，使菌和上層瓊脂鋪均勻。
使上層瓊脂在瓊脂平板上完全鋪平可能有些困難，特別是第一次使用大平板（直徑
15 cm) 時。鋪板前， 先將瓊脂平板在 37℃ 預熱 30~60
min，可以減慢上層瓊脂凝固的速度（這樣轉動平板這一步就有更多的時間）。上層瓊脂溫度高于 47℃ 會殺死感受態細菌（并明顯降低轉化率）。
17. 蓋上平板，室溫凝固 5 min, 用 Kimwipe 紙巾吸干平板蓋上的冷凝水，倒置平板，37℃ 培養。
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