MALDITOF在診斷傳染性疾病中的應用

　　Christopher Doern博士是西南德克薩斯州立大學兒科病理學助理教授，達拉斯兒童醫學中心臨床微生物學主任，該兒童醫學中心是美國第一家應用MALDI-TOF串聯質譜法鑒定微生物的兒科實驗室。2013年7月29日Christopher Doern博士于2013年AACC年會上發表題為《Applications of MALDI-TOF for the Diagnosis of Infectious Diseases》的報告，介紹了使用這項新技術的經驗及其如何改變我們診斷傳染病的方式，現將Doern博士的演講整理如下，以期指導該技術在臨床實驗室中的應用。

　　質譜分析法在微生物學中是一種創新，該基礎入門課程介紹了這項技術的不同組成部分，工作原理，確認程序，未來可能應用的方向，以及使用這項技術對病人護理的影響。

　　為了了解MALDI-TOF的影響，必須了解診斷傳染病的程序以及我們面對的連續統一體（continuum）。從傳統上來講，微生物學實驗室是最慢的實驗科室，可能需要數天來完成檢測。我們從標本收集、運輸和處理開始，在醫院中需要數小時。然后是培養階段，也是使我們落后的階段，在沒有獲得微生物之前我們什么也做不了。標準的細菌微生物培養需要24-48個小時，真菌或分支桿菌培養時間更長。最后是分析階段，時間為一天或更長，分析方法通常依據培養而定。因此，在發布確定性鑒定和易感性結果之前需要數天（圖1）。那我們在哪里做治療決定呢？因為改變病人管理的方式是我們的目標，所以答案是在整個過程中。醫生在決定病人患病的期間調整治療方法，因此我們盡可能發布更多信息。問題在于讓微生物學家受挫折的是，在他們獲得最可靠最確定的信息之前醫生已經做了3或4個治療決定。最后，在大多數情況下我們對病人治療方法的作用很小。

圖1 臨床連續統一體中的微生物學

　　微生物學為什么這么慢？一個很好的例子是在分析之前需要培養。我們經常面對混合培養，不只有一個分析物，有些標本包含很多不同的微生物。如果我們對其中一種微生物感興趣我們必須再次培養（subculture），經過純粹培養后才能進行鑒定。我們使用基于培養的系統，這也需要時間。5-10年后，我們可能直接根據標本類型檢測鑒定，但是現在我們還沒有到那個程度，所以我們仍需收集標本，培養標本然后分析。

　　傳統做法是先培養，觀察到微生物后再次培養。微生物生長時間需要16-18個小時，然后進行鑒定和敏感試驗，鑒定最少需要6-8個小時，直到獲得鑒定結果需要3天。MALDI-TOF可從單菌落或單分離菌落鑒定。我們之前做次代培養，現在直接把微生物放到鋼板上，放入儀器分析。這是蛋白分析，不是基于培養的分析。生物化學反應通常需要6-24個小時，現在我們只需30秒。周轉時間得到顯著提高。

　　

圖2 傳統工作流程

　　細菌鑒定MALDI-TOF技術有2個選擇：一個是Bruker Microflex（布魯克），另一個是bioMerieux Vitek MS（生物梅里埃），都僅供研究使用（RUO），都在申請FDA批準。我們實驗室使用的是BrukerMicroflex，但是兩個儀器或兩項技術的工作流程是相似的。因此，使用Bruker Microflex的很多經驗也適用于bioMerieux Vitek MS。

　　

圖3 兩個廠商的儀器圖，左：Bruker Microflex（布魯克），右：bioMerieux Vitek MS（生物梅里埃）

　MALDI-TOF程序

　　標準工作流程是把標本和基質放到靶板上，待其干燥，放入容器。在分析階段，激光電離使蛋白質產生光譜。光譜圖分析本質上就是微生物的指紋譜。把蛋白質分析與數據庫比較，數據庫包括代表各種微生物的4,000或5,000個不同光譜。模式匹配得出分數，分值大于2.0鑒定到種，所以綠膿桿菌是確信的物種。分值在1.7-2.0之間鑒定到屬，即可以鑒定到假單胞菌屬而不能鑒定出是綠膿桿菌。為了微生物學家簡便起見，還做了顏色編碼。綠色代表可以繼續（確信物種），黃色代表警告（確信屬），紅色代表停止（鑒定不可信），見圖4。

圖4 工作原理　　

　　有很多種基質作為研究工具用于微生物學實驗室，常用的MALDI基質物質如下所示：

　　肽 類：4-羥基-α-氰基肉桂酸（HCCA）

　　蛋白質：2,5-二羥基丙酮（DHAP）

　　芥子酸（SA）

　　2,5-二羥基苯甲酸（DHB）

　　多 糖：2,5-2,5-二羥基苯甲酸（DHB）

　　核 酸：3-羥基吡啶酸（HPA）

　　2,4,6-三羥基苯乙酮（THAP）

　　不同類型樣品使用不同的基質與電離特殊樣品混合物所需的能量（每種基質顯示特定能量閾值）和特殊樣品混合物的穩定性（熱基質可導致樣品化合物的非預期斷裂）有關。

　　與我們所做的相比，MALDI-TOF程序既美觀又簡單（圖5）。微孔板大小與信用卡差不多。“信用卡”內有96個孔，非常小，需要在文件上記錄微生物的位置，用牙簽進行定位，用移液管把基質移取到微板上。分子生物學家能夠非常熟練使用移液管，而細菌生物學家則不行。他們在實驗室做到良好配合，細菌生物學家負責前期工作，分子實驗室負責移液工作，待靶板干燥，放入儀器。對于微生物學家來說這完全是外來技術，仍需要學習使用這項技術。

　　

圖5 MALDI-TOF程序

　　該質譜儀仍是RUO儀器，我們可以看到和改變其中的任何設置（圖6）。比我們在任何FDA批準儀器中看到的都多。從質譜儀內的一個小攝像機，你可以看到激光發射，從而評估標本質量。最重要的一個特點是可以獲得均勻分布的標本。不幸的是，一旦經FDA批準，這些就看不到了。我們必須實時觀察數據采集。你越熟悉這項技術，就能越早進行評估。

　　

圖6 改變質譜儀的設置

　　最后一步是分析，技師如何看待讀數? 我們有評分系統，給予一級和二級鑒定。一方面這樣是好的，但也給我們帶來了問題。我們得到一個分值描述或鑒定描述，必須知道如何處理。

　　

圖7 Bruker Biotyper分類結果

　　現在MALDI-TOF可以專業鑒定所有細菌，厭氧菌、所有革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，可以很好地鑒定酵母菌和分枝桿菌，還可以直接根據血培養陽性進行鑒定。這不是直接從病人鑒定，但是如果你熟悉血培養協議，可把血液注射到瓶子中培養一段時間，獲得標記結果為陽性，我們可以使用MALDI-TOF對該材料進行直接鑒定，所以它是非常強大的應用。

　　MALDI-TOF的其它好處。歐洲使用MALDI-TOF已有5年，比美國早很久，所以他們有我們沒有的經驗。他們發現MALDI-TOF是非常可靠的革蘭氏染色形態學測定。即使沒有得到很好的鑒定結果，革蘭氏染色結果也總是正確的。我提到歐洲的原因是他們現在所做的正是消除革蘭氏染色，這對于我們微生物學家來說是殘忍的，因為我們對任何微生物都做革蘭氏染色。但是他們發現革蘭氏染色是不必要的，因為MALDI-TOF結果非常可靠。另外，MALDI-TOF不會得出“錯誤”答案。雖然有些夸大，但是該技術使人耳目一新的是當它給出一個答案，可以確信答案是正確的。

　　

圖8 用MALDI-TOF MS鑒定720個臨床分離株的準確度。Shimadzu和Bruker儀器比較，不正確結果非常少，所以非常可靠。

　　另外，數據庫可以隨著時間完善，這對于觀察到不同類型菌株的實驗室來說是很重要的。如果我獲得了原來未鑒定的微生物，比如未鑒定的酵母菌，然后加入到數據庫，數據庫變得更大更好。

　　MALDI-TOF的局限性。雖然MALDI-TOF很可靠，但是它無法區分肺炎鏈球菌和輕型鏈球菌/口腔鏈球菌，我們仍需使用較慢的標準生化試驗。志賀菌屬是重要的胃腸道病原體，基本上等同于大腸桿菌。志賀菌屬不在數據庫內，所以MALDI-TOF無法鑒定志賀菌屬。MALDI-TOF還無法進行敏感試驗和鑒定混合標本。MALDI-TOF不會告訴你標本存在兩種不同的微生物，而只是告訴你存在微生物及其豐度。

　　確認程序

　　確認MALDI-TOF對臨床分離株的鑒定能力，就要確認它的重要組成部分。首先是點樣技術（spotting technique），如何使微生物定位到靶板上。其次，從什么培養基上進行點樣？走進微生物學實驗室，你會發現10-15種不同的培養基。你可以想象對于以蛋白質為基礎的分析，不同類型的培養基鑒定結果不同。第三是點樣滯后時間，在靶板上點樣一段時間后再鑒定。最后根據微生物種類進行確認。在最后確認時與常規實驗室方法比較，解決與16S測序方法的差異結果。

　　點樣方法。進行良好鑒定最重要的就是獲得均勻分布的樣品。我們想象牙簽的尖端不能做好點樣工作，所以在實驗室中我們開始使用的是拭子，但是后來發現有微粒從拭子上掉下來，就換成了牙簽。幸運的是，我們預先對牙簽和拭子都做了確認研究。之前提到分值范圍是1-3，圖9中Y軸縮短為1.9-2.5。在質譜鑒定中我們還要做濃縮。對同一種微生物進行重應用（heavy application）和輕應用（light application），包括大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、ENTC（腸球菌）。在所有這些鑒定中沒有顯著統計學差異，分值都超過了2.0。所以牙簽或拭子都可用于我們的研究，只是我們一開始使用的是拭子。

　　圖9 點樣方法

　　培養基性能評估。微生物學工作流程的一個重要部分是次代培養獲得純粹生長（圖1）。檢測從選擇性培養基獲得的之前經過特性化描述的相關微生物的次培養物。（圖10）上圖反映隨機閾值是70%鑒定率。如果你想從圖中任何一個培養基進行鑒定，有些是非常合適的篩選培養基。從圖中可以看出所有培養基的鑒定率都遠大于70%。 在獲得鑒定結果時，我們希望鑒定分值大于2.0或者是可靠的鑒定。從下圖來看，在大多數情況下鑒定率都很好，只有MAC+CAZ效果不太好。

　　

圖10 培養基性能評估

　　數據庫評估/確認。如果你想確認實驗室的所有代表微生物，你就不能按照實驗室接收的檢驗申請來確認。因為我們在實驗室看到的95%微生物都是大腸桿菌和葡萄球菌。革蘭氏陰性菌的范圍廣泛，代表菌類有腸桿菌科、葡萄糖非發酵菌、需要復雜營養的革蘭氏陰性桿菌和雙球菌。確認標準是最少300個分離株。每個種不超過20個分離株，每個屬不超過30個分離株。可用相關微生物例如GC（淋球菌）、B. cepacia（洋蔥伯克霍爾德菌）、HACEK等等增補。

　　革蘭氏陽性菌沒那么多樣化，納入標準較為寬松。確認標準是最少200個分離株。每個種不超過30個分離株，每個屬不超過50個分離株。代表菌類球菌和桿菌。革蘭氏陽性菌的代表較少，可用棒狀桿菌屬、諾卡氏菌屬等相關微生物增補。

　　革蘭氏陽性和陰性厭氧菌的最低納入標準是最少100個分離株。每個種不超過20個分離株，確認必須包括至少5個物種。酵母菌的最低納入標準是最少100個分離株，每個種不超過30個分離株。這些只是最低目標，我們在做實驗時通常超過這個數量。

　　原始的簡單工作流程一般是先點樣微生物和覆蓋基質，然后進行鑒定。結果表明這種方法對于有些微生物效果不太好。所以我們把微生物點在靶板上然后用甲酸覆蓋，從而使蛋白質顯現出來。最后用基質覆蓋。這樣需要更長時間。從圖11來看，事實上甲酸覆蓋對于革蘭氏陰性菌沒有多大變化。與我們預想的一致，它們的蛋白質本來就可以檢測到，所以，甲酸覆蓋沒有優勢。大多數物種都被可靠鑒定出來，能非常可靠地鑒定伯克氏菌屬。但是，5個成團泛菌中沒有一個被鑒定出來。

　　

圖11 甲酸覆蓋與直接圖片法：革蘭氏陰性菌

　　使用或不使用甲酸對革蘭氏陽性菌的影響完全不同（圖12）。未使用甲酸的失敗率高（80%）。使用甲酸的失敗率只有5%，鑒定正確率為100%。使用甲酸可100%鑒定到種，平均分值是2.36。失敗=無峰值或無可靠的鑒定。

　　

圖12  甲酸覆蓋與直接圖片法：革蘭氏陽性菌

　　甲酸覆蓋對酵母菌鑒定更好。對于酵母菌鑒定，不使用甲酸的鑒定率只有8%。因此，重復檢測的可能性是92%。如果使用甲酸，鑒定率是100%且分值在1.7以上的鑒定都是正確的。這樣以來使廠商的推薦閾值從分值在2.0以上降低到1.7以上。

　　圖13 酵母菌鑒定

　　解釋數據和解決問題

　　復合菌問題

　　像這樣改變工作流程時，會出現很多問題。其中一個問題是“復合菌”問題。微生物分類廣泛，有很多亞群。MALDI-TOF能把復合菌內的很多微生物鑒定到物種水平。例如，實驗室最常見的兩種非常重要的病原體，陰溝腸桿菌和洋蔥伯克霍爾德菌。但是它們是非常復雜的種群，包括大量其它微生物（表1）。

　　

表1 MALDI-TOF鑒定復合菌

　　未來應用

　　直接標本檢測。根據使用標本類型不同，進行鑒定需要的微生物單位要求不同，例如尿液-100,000CFU/mL，血液10-1,000CFU/mL，而CSF要求的微生物范圍廣泛。另外，可以直接鑒定多微生物標本嗎？答案是不能得出是哪種微生物，只可以告知存在微生物及其豐度。從各種情況來看，對尿液標本進行直接檢測是最好的，尿液的有意義臨床閾值是100,000CFU/mL。因為對于絕大多數尿路感染（UTI）來說，唯一關心的就是物種豐度。在臨床化學雜志第49卷第4期Ferreira等人（文章標題：利用基體輔助激光解吸電離飛行時間質譜直接鑒定尿樣中的尿路感染病原體）比較了瓊脂培養板上菌落與尿液樣品中菌落的MALDI光譜（圖14）。黃色質譜的大腸桿菌大于105CFU/mL，分值為2.348，是很好的鑒定。紅色質譜的大腸桿菌7x104CFU/mL，分值為1.548，不是很可靠的鑒定。所以，直接標本檢測幾乎是尿路感染的配套診斷檢測。

圖14 在不同情況下生長的大腸桿菌細胞的質譜

圖15 不同大腸桿菌、綠膿桿菌和屎腸球菌計數的MALDI-TOF分值。MALDI-TOF看似需要高細菌計數來提供可靠的鑒定

　　用傳統鑒定法和MALDI-TOF法處理經篩查設備報告為陽性的260例尿液樣品。結果如表2所示。篩查設備報告為陽性的20例樣品在培養結果中顯示為陰性。在這20例樣品中MALDITOF沒有發現任何顯著的蛋白質分析。篩查結果為陽性的5例樣品導致培養中兩種菌落大量生長。在這些樣品中，MALDI-TOF報告了2例不可靠鑒定，另外3例微生物正確鑒定。在傳統方法鑒定的235例單微生物標本中，MALDI-TOF檢測到205例相同的微生物，和28例陰性或不可靠鑒定。證明MALDI-TOF不能保證100%可靠的鑒定。

　　

表2 用傳統方法和MALDI-TOF MS診斷尿路感染的關聯

　　敏感試驗。微生物有不同的抗藥方式。迄今為止最常見的是酶促改變/酶促降解。微生物事實上改變了藥物本身，例如β-內酰胺。微生物進行有效活動使抗生素氫化或分解抗生素。所以我們應用MALDI-TOF進行敏感試驗。其他機制包括微生物改變抗生素的靶標或某些靶標生產過剩等。

　　使用MALDI-TOF快速檢測氨芐青霉素抗藥性。用測試微生物孵育純化氨芐青霉素2小時后測量分解產物（Grundt et al. 2012. JCM）。這個實驗不是檢測機制本身，而是檢測機制的產物。標準敏感試驗需要24個小時或更長，是個很慢的過程。MALDI-TOF使抗生素完全氫化到可以測量的點需要2個小時，因此敏感試驗需要2個小時。局限性是我們只能告訴醫生不能使用氨芐青霉素，不能告訴其他類型抗生素的信息。

　

　　圖16：（A）MS全掃描分析表明氨芐青霉素及其水解產物氨芐青霉素-青霉酸和青霉噻唑酸的檢測。（D）動力學細菌氨芐青霉素水解分析表明氨芐青霉素的量不斷降低而相反氨芐青霉素-青霉酸增加。氨芐青霉素在120分鐘后完全降解。孵育30分鐘后，藥物/代謝物之比能可靠地區別氨芐青霉素易感性和抗藥性。

　　使用MALDI-TOF檢測碳青霉烯抗藥性是另一個熱點。近年來，抗碳青霉烯類細菌的百分比以令人擔憂的速度在上升并成為病人存活率的重大威脅。可使用MALDI-TOF質譜法通過檢測碳青霉烯降解來證實碳青霉烯酶誘導的碳青霉烯抗藥性。這種方法對攜帶NDM-1、VIM-1、VIM-2、KPC-2和不同 IMP酶的菌株有效（Burckhardt andZimmermann. JCM. 2011. 49(9):3321-4）。

　　菌株分型。坦白來說，使用MALDI-TOF進行菌株分型較慢（可能在一天或兩天內完成），通常不能在有用的時間段里得出結果。但是有可能比PFGE（脈沖電場凝膠電泳）、多種測序分型、快速PCR快而便宜。MALDI-TOF可區別的微生物包括弧菌，軍團菌屬，大腸桿菌，擬桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，金黃色釀膿葡萄球菌。

　　MALDI-TOF對病人護理的臨床影響

　　我們在實驗室使用MALDI-TOF大約1年。下表總結了很多微生物學評估。它們使用這些技術評估對病人護理的影響是否有利。除了一個案例（紅色標注），其他所有案例采用的技術都對病人護理的影響有利。

　　表3 更快獲得結果是否等于對病人的更好護理

　　MALDI使用前發布鑒定結果的時間是從6:00 AM或8:00AM到3:00PM或4:00PM，這是一個非常寬泛的時間窗口。基本上意味著醫生不知道到底什么時候得到信息。使用MALDI的目標是80%的鑒定結果要在12:00PM之前報告出來。在預計時間發布信息可提高醫生的理解力。在臨床傳染病雜志第49卷第4期上Seng等人表示在下午1點申請檢測，第二天上午9:30可獲得結果。

　　

表4 兩種截然不同的培養方法的工作流程對比

　　囊性纖維化培養

　　在MALDI使用前明確性鑒定的平均時間是141個小時（5.9天），在MALDI使用后明確性鑒定的平均時間是77個小時（3.2天），所以鑒定時間有了顯著提高。MALDI-TOF不做敏感試驗，預計周轉時間不會變化。但是，事實上在MALDI使用前易感性測試的平均時間是134個小時（5.6天），而在MALDI使用后平均時間為105個小時（4.4天）。因此即使我們不做敏感試驗，周轉時間也提高了。為什么會這樣呢？原因是在你知道微生物是什么值錢，不能發布敏感試驗結果。在MALDI使用前，鑒定所需的檢測方法的平均數量是1.5個方法。這個數字聽起來不多，但是也就是說三分之一的培養需要一個以上方法，意味著我們第一次沒能鑒定微生物，還要用另外的方法來鑒定。在MALDI使用后鑒定所需的檢測方法的平均數量是1個方法，除了MALDI-TOF，我們不用其他方法。總的來說，使用MALDI-TOF使鑒定結果提前2.7天發布，敏感試驗結果提前1.2天發布。使用MALDI前后，培養開始的平均時間是下午3點和2點。鑒定結果發布的平均時間都是下午12點。使用MALDI之前，48%的結果在下午12點之后發布；使用MALDI之后，52%結果在下午12點之后發布。所以我們幾乎在同一時間獲得培養和鑒定結果發布。這有些令人失望，因為我們每天9:30開始MALDITOF，希望更早獲得結果。但是使用MALDI前的標準差是215分鐘，使用MALDI后的標準差是139分鐘。使用MALDI后的時間窗口更小。

圖17 使用MALDI前后鑒定結果發布的平均時間相同，但是更多結果在下午獲得　　

　　血液培養

　　血液培養是迄今為止較為緊急的臨床培養。在MALDI使用前明確性鑒定的平均時間是81個小時（3.4天），在MALDI使用后明確性鑒定的平均時間是54個小時（2.3天）。我們多了另外20多個小時進行次代培養。MALDI使用前易感性測試的平均時間是95個小時（4.0天），而在MALDI使用后平均時間為73個小時（3天）。我不知道為什么敏感試驗的時間會提高，但是唯一合理的解釋應該與囊性纖維化培養相似。鑒定結果提前1.1天發布。敏感試驗的周轉時間提前了1天。使用MALDI前后，培養開始的平均時間都是下午2點。鑒定結果發布的平均時間分別是上午11點，和上午11:30（但是提前一天的11:30）。使用MALDI后，只有15%結果在下午12點之后發布。所以，我們不僅提前了1天獲得鑒定結果，還是在提前1天的早些時候獲得的。

　

圖18 使用MALDI后時間窗口更緊湊，標準差280分鐘 vs. 118分鐘