MALDITOFMS在臨床微生物樣本直接檢測中的應用（二）

三、MALDI-TOF MS在臨床樣本直接檢測中的應用

從臨床樣本直接檢測微生物可以節省轉種培養的時間。目前已取得顯著進展的是從血培養陽性樣本中直接檢測細菌和酵母樣真菌, 而從中段尿和其他無菌體液樣本中的直接檢測也在快速發展。

(一)血流感染病原菌的快速檢測

血流感染的發病率和死亡率都相當高, 快速準確的血流感染病原菌鑒定對于臨床抗菌藥物的合理使用和病愈率的提高至關重要。直接檢測能顯著減少鑒定時間(< 29 h), 使得在血培養陽性的第1個24 h內接受適當抗菌藥物治療的患者增加11%[14]。CLERC等[15]認為基于MALDI-TOF MS 對血培養陽性樣本的檢測可能會成為血培養陽性患者管理中除了革蘭染色報告之外的第2個關鍵步驟。近年來, 有不少的研究應用MALDI-TOF MS直接鑒定臨床微生物樣本, 取得明顯進展的是從血培養陽性樣本中直接鑒定細菌和酵母樣真菌[5, 10, 16], 而混合菌和厭氧菌等的鑒定還有待更多的研究。

1.鑒定效能 (1)細菌:在引起血流感染常見菌的鑒定方面, MALDI-TOF MS技術已經在腸桿菌科細菌、葡萄球菌等病原菌的直接鑒定方面取得了很好的鑒定結果。大量的研究評估了MALDI-TOF MS用于直接鑒定陽性血培養瓶的表現, 不同文獻報道的種水平的鑒定率在54%~99%不等[5, 10, 11, 17, 18, 19], 主要是由于所鑒定細菌種類/數量的不同, 或是運用了不同的預處理/提取方法, 或是定義了不同的cut-off值。SCHMIDT等[19]、SCHUBERT等[20]應用不同的操作程序直接鑒定陽性血培養瓶樣本, 結果顯示103株代表臨床最常見的13個屬24個種的樣本中, MALDI-TOF MS準確鑒定其中的72%(86.6%革蘭陰性菌, 60.0%革蘭陽性菌); 500例樣本中, 其中革蘭陽性菌358例, 革蘭陰性菌98例, 總體種的鑒定率達到了86.5%, 其中革蘭陽性菌是89.8%, 革蘭陰性菌是86.3%。國內最新的研究也顯示, 陳峰等[21]運用分離膠促凝管聯合MALDI-TOF MS直接檢測, 革蘭陰性菌和革蘭陽性菌中有84.0%和75.0%能被準確鑒定到種的水平; 對于血流感染中最常見的病原菌的菌種鑒定符合率達到83.3%~96.9%。以上研究均顯示了MALDI-TOF MS在血流感染直接鑒定方面的良好表現, 并呈現出了如下特點:對革蘭陰性菌的鑒定率比革蘭陽性菌高; 無莢膜的細菌較有莢膜的細菌(細胞壁難以破壞提取到足夠的菌體蛋白)的鑒定率高; 混合細菌感染時鑒定能力有限, 多數情況下只能鑒定出其中一種優勢細菌; 對草綠色鏈球菌的鑒定效果較差(鑒定不出, 或將緩癥鏈球菌鑒定為肺炎鏈球菌)[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20], 需要進行另外的確證試驗; (2)真菌:MALDI-TOF MS在鑒定酵母菌方面有較高的鑒定率。FERRONI等[18]、YAN等[16]的研究表明酵母菌鑒定的正確率可達91%~100%。但是也有學者得到了相反的結果, GORTON等[13]和PAOLUCCI等[22]直接鑒定的正確率只有56%和41%, 可能是因為鑒定使用的血量過少(1.5 mL), 或是在處理樣本的過程中樣本的丟失導致了低鑒定率; (3)其它細菌:目前關于厭氧菌的直接鑒定的報道較少, 并且顯示了鑒定成功率并不理想, 可能是因為厭氧菌對生長條件的要求較為苛刻, 導致增菌的數量達不到要求, 還需要更多的研究來優化其鑒定條件。

2.不同的檢測方法 上述結果均是MALDI-TOF MS直接檢測報陽血培養瓶的樣本所得到的。有研究表明報陽血培養瓶的樣本也可以轉種到固體培養基上進行短暫孵育(如2~4 h)后再進行鑒定, 則具有更大的優勢。KROUMOVA等[23]在質譜法分析實施蛋白提取程序之前, 將樣本富集到一個增菌培養基中孵育大約2 h后再進行質譜分析, 同時達到增菌和減少血液成分干擾的目的, 提升了鑒定分數, 使鑒定結果更可信; IDELEVICH等[24]將血培養陽性的樣本轉種到血平板孵育1.5、2、3、4、5、6、7、8、12和 24 h(對照), 分別直接進行MALDI-TOF MS檢測, 直到有可靠的到種水平的鑒定結果出現(鑒定分數≥ 2.0), 結果發現革蘭陽性球菌平均鑒定到種所需要的孵育時間是5.9 h, 革蘭陰性桿菌平均鑒定到種所需要的孵育時間是2 h。如果增加了蛋白提取程序, 革蘭陽性球菌的孵育時間將縮短至3.1 h, 但對革蘭陰性桿菌的影響不明顯。這種方法可以有效地減少額外的人工操作時間和費用。HONG等[25]的研究也表明, 這種方法能得到可靠的鑒定結果(與傳統生化方法的屬水平的一致率是98.9%), 并且這種方法不會受血培養系統的影響, 成本低, 易于操作。

3.與藥物敏感性聯合檢測 為了克服MALDI-TOF MS不能做體外藥物敏感性試驗的不足, MALDI-TOF MS已經開始與藥物敏感性試驗聯合用來直接檢測陽性血培養瓶的樣本[26], 用不含活性炭的血培養基在過濾和洗滌之前用溶解細胞的緩沖液進行孵育, 然后將從過濾膜上收集的微生物直接進行MALDI-TOF MS分析, 剩下的樣本用VITEK 2系統孵育并進行藥物敏感性試驗, 將94.0%的樣本鑒定到了種的水平, 藥物敏感性試驗與傳統方法相比有93.5%的一致率, 并且相較于傳統的56.3 h, 新方法鑒定和藥物敏感性試驗所用的時間縮短到了11.4 h。證明了在一天內完成微生物鑒定和藥物敏感性試驗的可行性。為獲得更好的治療爭取了時間并且減少了住院的費用[27]。

4.檢測結果的影響因素 有研究指出不同的血培養瓶和血培養系統可能會產生鑒定結果的差異[19, 28, 29]:使用含有活性炭的血培養瓶和BacT/alert血培養系統的鑒定率較低, 使用含有樹脂的血培養瓶和BACTECTM血培養系統鑒定率較高。其中一項研究比較了含有活性炭的和不含活性炭的血培養瓶在BacT/alert血培養系統下的鑒定表現, 發現使用不含活性炭的血培養瓶的MALDI-TOF MS的鑒定率為30%, 而含有活性炭的血培養瓶的鑒定率只有8%[28]。而另一項研究比較了3種不同的血培養系統— — BACTECTM, VERSATREK和BacT/alert對鑒定率的影響, 經這些鑒定系統培養的陽性血培養瓶的鑒定成功率分別是76%、69%和62%[29]。此外, 使用不同的細菌蛋白提取程序也會影響鑒定成功率[11]。

(二)泌尿系統感染病原菌的快速檢測

因泌尿系統感染的中段尿樣本中的細菌量相對很高, 中段尿樣本也是MALDI-TOF MS直接檢測的理想選擇[30], 并且常常是單一菌種感染, 避免了MALDI-TOF MS在鑒定混合菌樣本的不足[31]。泌尿系統感染是人類常見的感染性疾病, 臨床泌尿系統感染最常見的病原菌為大腸埃希菌(70%~95%)、腐生葡萄球菌(5%~10%)以及其它腸桿菌科細菌, 如奇異變形桿菌和肺炎克雷伯菌。有研究表明MALDI-TOF MS對尿液樣本中這些細菌的鑒定效率和準確率要優于傳統鑒定方法和其他鑒定系統[7, 32, 33]。

1.鑒定效能 FERREIRA等[7]選取尿液中細菌大于1× 10^5 cfu/mL的樣本進行直接的MALDI-TOF MS鑒定, 結果顯示尿液樣本經過差速離心法處理后, 可將91.8%的菌株鑒定到種、92.7%的菌株鑒定到屬的水平。

楊溪等[33]使用MALDI-TOF MS技術對臨床收集到的1 040份尿液樣本進行直接快速檢測, 共鑒定出含細菌的樣本526份, 其中尿細菌培養菌落數≥ 1× 105 cfu/mL, 培養出1種/2種菌的尿液樣本MALDI-TOF MS的直接鑒定率分別為92.7%(430/464)和75%(96/128)。MALDI-TOF MS直接檢測法的鑒定結果與尿細菌培養法鑒定出的細菌菌種一致, 符合率為100%。

2.與流式細胞術聯用 懷疑泌尿系統感染的尿液樣本一般經離心后取沉淀直接進行檢測, 但考慮到臨床上有60%~80%的尿液樣本是陰性的, 為了減少分析的時間和人工的工作量, 有學者將MALDI-TOF MS與流式細胞術聯用檢測, 用流式細胞術篩除細菌數量不足的尿液樣本, 而MALDI-TOF MS用來檢測篩選結果為陽性的尿液樣本, 取得了良好的鑒定效果[34, 35]。MARCH ROSSELLó 等[34]建立了這樣一種微生物鑒定程序:先用流式細胞儀進行菌落計數篩查出單一細菌陽性的尿液樣本, 然后再進行MALDI-TOF MS檢測, 發現細菌數在1× 10^7 cfu/mL時是足夠的細菌濃度, 有87.5%的敏感性, 而細菌數在(1× 10^5)~(1× 10^7)cfu/mL之間的樣本經過4 h的預增菌, 得到用于分析的足夠的細菌數量后, 可以達到91.7%的敏感性。

3.細菌含量對鑒定結果的影響 由于中段尿中病原菌數< 1× 10^5 cfu/mL時也有可能預示著尿路感染, ROSSELLó 等[12]研究了不同細菌濃度對直接鑒定準確率的影響, 結果表明大多數情況下細菌數≥ 1× 10^5 cfu/mL的樣本能產生更高的鑒定分數(接近或> 2.0), 而隨著樣本中細菌數的降低, 鑒定成功的比例和鑒定分數也在下降, 當菌落數< 1× 10^4 cfu/mL時, 不能得到可靠的鑒定結果; 并且發現在每一個細菌濃度下, 腸桿菌科的細菌均顯示了更高的鑒定分數和鑒定準確率; 革蘭陰性菌的鑒定分數和鑒定成功率要比革蘭陽性菌高, 這與在血樣本直接鑒定得到的結果一致; 對于4株酵母菌樣本, 2個菌落數≥ 1× 10^5 cfu/mL的樣本能被準確鑒定, 而菌落數在(1× 10^4 )~(5× 10^4)cfu/mL時則不能鑒定。而王琳等[36]的研究發現, 單一菌感染且細菌數> 1× 10^4 cfu/mL的中段尿樣本, 應用MALDI-TOF MS直接檢測即可取得滿意的鑒定效果。

4.中段尿樣本直接檢測的新方法 DEMARCO等[31]近期描述了一種透析過濾的方法, 通過脫鹽、分餾、富集等步驟對100例陽性尿液樣本在MALDI-TOF MS分析前進行了預處理, 實驗結果表明這種預處理方法能夠正確地鑒定陽性尿液樣本, 并且正確分類了所有臨床相關菌尿癥的陰性尿液樣本, 包括一組污染的尿液樣本和一組臨床上無關緊要的定植菌。敏感性和特異性分別是67%和100%。

5.中段尿樣本直接檢測的不足之處 與直接檢測培養陽性的血樣本一樣, 對于含有2種或2種以上細菌感染的中段尿樣本, MALDI-TOF MS常常表現為鑒定能力不足[33, 35]; 尿液蛋白質如α -防御素[8]會造成鑒定結果不能正確匹配數據庫; 對酵母菌的鑒定能力也有待于進一步提高; 對于核糖體蛋白序列差異很小的菌種也常常不能區分。

(三)其它無菌體液

MALDI-TOF MS直接檢測和鑒定其它無菌體液樣本如腦脊液、胸腹水和關節液等中細菌的報道尚不多。NYVANG HARTMEYER等[37]首次報道了通過直接將腦脊液樣本離心取上清直接進行MALDI-TOF MS分析, 肺炎鏈球菌性腦膜炎可以在30 min內做出診斷, 為后續治療方案的選擇和結果的解釋提供了重要的參考依據。SEGAWA等[38]也用同樣的方法對一例肺炎克雷伯菌引起的腦膜炎做出了診斷, 但同時也指出在實際應用中能獲得的樣本量少, 細菌數少可能會限制它的應用。另外, 還可將無菌體液樣本轉移到血培養瓶中進行孵育, 待報陽后進行檢測也是可行的。有研究應用MALDI-TOF MS檢測了46份液體, 包括移植養護液、關節液、深部膿皰樣本、骨小孔樣本用血培養基孵育, 發現44/46(96%)能鑒定到種的水平, 余下的2份被鑒定到屬的水平[18]。