MALDITOFMS在臨床微生物檢驗中的應用進展

　　1、前言

　　從目前的情況來看，大多數的微生物實驗室采用的是一些傳統的細菌鑒定手段，如革蘭氏染色、氧化酶等生化反應，或者是采用梅里埃公司的API和Vitek鑒定系統。這些檢測手段都很浪費時間，通常需要六到八個小時，對于一些難培養的細菌鑒定來說，將會耗費更多的時間。有時候我們也會采用一些分子生物學上的手段，來展開鑒定，如對16SrDNA展開分析。不過16SrDNA對于生長慢和難培養的細菌鑒定起來比較困難，對于實驗人員的素質要求和經驗比較高，價格也是昂貴的。MALDI-TOF MS的出現，或許將改變這種現有的診斷模式，其方法簡便、快速以及可靠的優點必將得到普遍認同。這項技術將會將細菌的鑒定時間由以小時計算推進到以分鐘計算，聽起來就令人感到興奮。

　　MALDI-TOF MS（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）即基質輔助激光解析電離飛行時間質譜作為一種新型的軟電離生物質譜技術，被越來越多的應用于生命科學等領域的多個學科，不僅具有靈敏度高、準確度高且易于自動化等優勢，而且較之傳統的檢測方法，MALDI-TOF MS檢測的快速、對急性病例或特殊病原菌的準確檢測及其在耐藥方面的應用使其擁有更好的發展前景。

　　應用傳統的化學方法對常見細菌進行鑒定，仍然是現在大多數實驗室所采取的鑒定方法，但是對于一些難鑒定菌及培養要求苛刻的病原體，常規鑒定方法并不能滿足實驗室及臨床的應用。然而，MALDI-TOF MS技術不僅能夠快速鑒定，而且也為微需氧菌、厭氧菌、真菌、結核分枝桿菌及病毒等難鑒定、難培養病原體的鑒定彌補了生化鑒定方面的不足。目前，MALDITOF MS在食源性監測及科研等中的應用日益增多，也被臨床實驗室逐漸所采納。

　　2、MALDI-TOF MS的基本原理

　　2.1 MALDI-TOF MS的組成

　　儀器主要由兩部分組成：基質輔助激光解吸電離離子源（MALDI）、飛行時間質量分析器（TOF）。

　　2.2 MALDI-TOF MS的工作原理

　　基于不同的微生物具有不同的蛋白質譜圖，而MALDI-TOF MS可電離相對分子質量為100~1000000的生物分子，電離后不同的離子又具有不同的質荷比，質譜也能找出種間和株間特異保守峰作為生物標記從而將其區分開，所以MALDI的具體原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，從而使生物分子電離，適用于混合物及生物大分子的測定。而TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比檢測離子。根據檢測的結果與數據庫中的參考圖譜進行比對，從而得到結果。

　　3、MALDI-TOF MS的常規應用

　　3.1 MALDI-TOF MS對常見細菌的鑒定

　　對于臨床中的不同標本如鼻咽分泌物、咽拭子、腦脊液、胸腹水、肛拭子及尿液等進行微生物培養后，將其菌落進行質譜鑒定，據統計MALDI-TOF MS能準確鑒定大部分革蘭陽性菌和革蘭陰性菌如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、放線菌屬、奴卡菌屬、棒狀桿菌屬、紅球菌屬、腸桿菌科細菌、變形桿菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、不動桿菌屬、耶爾森菌屬等。

　　張明新等復蘇560株臨床分離株，應用MALDI-TOF MS鑒定臨床常見病原菌。MALDI-TOF MS與Vitek2Compact鑒定結果比較，G+細菌鑒定符合率為94.6％（246／260），G-細菌鑒定符合率為96.7％（174／180），酵母菌鑒定符合率為95.0％（57／60），腸道致病菌鑒定符合率為93.3％（56／60）。15株鑒定結果不符的菌株經16SrDNA測序確認，結果與Vitek-Compact和MALDI-TOF MS鑒定符合率分別為26.7％（4／15）和66.7％（10／15）。Sogawa K等將從臨床實驗室獲得的468株菌落直接點靶進行MALDI-TOF MS鑒定，物種和屬各級的識別率分別為91.7%（429/468）和97.0%（454/468）。

　　由于不動桿菌屬需要不同的治療措施，所以對其的快速且準確的診斷是十分重要的。Kishii K等應用MALDI-TOF MS對分離自血液中的123例不動桿菌屬標本的研究顯示：能夠確認到種的有106/123（86.2%），而16/123（13.0%）只能鑒定到不動桿菌屬。并對106株標本進行了基因序列測定，其中89/106（84.0%）與MALDI-TOF MS的鑒定是一致的。研究還顯示這123株屬于13種不動桿菌屬，而且皮氏不動桿菌的感染率超過了鮑曼不動桿菌達到42/12 3（34.1%）。

　　3.2 MALDI-TOF MS對微需氧及厭氧菌的鑒定

　　近年來隨著臨床對微需氧及厭氧菌的日益重視，對其的檢測研究逐漸增多，其培養陽性率也逐漸提高。但微需氧及厭氧菌對培養條件及鑒定條件要求苛刻，傳統生化鑒定技術很難滿足臨床實驗室快速準確鑒定微需氧及厭氧菌的要求。對于空腸彎曲菌等微需氧菌的鑒定目前仍缺乏統一的鑒定方法，利用MALDI-TOF MS技術對其進行鑒定漏診率及所需時間都大大降低，既滿足了臨床對確診的需要，也滿足了臨床快速鑒定的要求。

　　袁梁等人利用MALDI-TOF MS技術對56株厭氧菌進行了研究顯示：53株MALDI-TOF MS與16SrRNA基因序列鑒定結果一致，符合率達94.6%，傳統生化Vitek32 ANI鑒定卡45株鑒定結果與16SrRNA基因序列鑒定結果一致，符合率為80.4%。與基因鑒定結果相比較，MALDI-TOF MS技術鑒定符合率高于傳統生化鑒定技術。

　　3.3 MALDI-TOF MS對真菌的鑒定

　　目前，臨床上對于真菌的鑒定主要有傳統的微生物鑒定法、Vitek微生物鑒定系統及MALDI-TOF MS法。傳統微生物鑒定中對于真菌一般有壓片、染色鏡檢，觀察其菌絲和孢子，接種沙保羅培養基（固體和液體），咖馬伽顯色培養基，由于真菌生長周期長，傳統方法無法滿足臨床對于病原菌快速而準確鑒定的要求。

　　有報道稱，對于臨床分離得到的241株真菌通過MALDI-TOF MS進行鑒定（包括念珠菌、隱球菌、紅酵母），92%均能準確鑒定到種的水平。在真菌的鑒定方面許多研究證實MALDI-TOF MS能夠用來鑒定多種真菌，尤其是臨床比較常見酵母菌，也能對青霉、曲霉、鐮刀菌、以及皮膚真菌等進行鑒定。

　　3.4 MALDI-TOF MS對結核及非典型分枝桿菌的檢測

　　由于結核及非典型分枝桿菌的營養要求高（必須在含血清、卵黃、馬鈴薯、甘油以及含某些無機鹽類的特殊羅氏培養基上才能生長良好）、生長緩慢（14～18h分裂1次，在固體培養基上2～5w才出現肉眼可見的菌落），傳統微生物鑒定只能通過抗酸染色、培養、PCR等對其進行鑒定，不僅費時，而且PCR對試驗條件和人員素質要求均較高，成本較大。而MALDI-TOF MS則可以快速而準確的獲取其特異的蛋白質譜圖，通過與數據庫的比對快速得出結果。

　　此外，與VITEK-MS系統相比，應用MALDI-TOF MS對臨床分離株進行鑒別，從基因水平和物種水平兩方面的鑒定率分別為87.3%和62.8%，均優于VITEK-MS系統。運用16SrRNA進行基因測序無法區分膿腫分枝桿菌和龜分枝桿菌，而質譜則可以，其鑒定率為57.1%（12/21）。

　　3.5 MALDI-TOF MS對病毒的檢測

　　至今為止，應用MALDI-TOF MS技術來檢測病毒方面的報道很少，但有報道可用MALDI-TOF MS來鑒定病毒融合蛋白，來確定病毒株的毒力、病毒糖蛋白、衣殼蛋白。還有報道用MALDI-TOF MS通過病毒蛋白不同的分子量從病毒基因組水平來鑒別特定限制性片段，或者用來鑒別特異的基因突變。

　　3.6 MALDI-TOF MS對細菌的毒力因子鑒定

　　應用MALDI-TOF MS對金黃色葡萄球菌的毒力因子鑒定已有報道，然而需要先在SDS-PAGE上提取蛋白。近日，Bittar等，成功的使用MALDI-TOF MS鑒定出了PVL（Panton–Valentine leukocidin）陽性的葡萄球菌。應用ClinProToolsTM軟件（布魯克道爾頓，德國）分析，在57株PVL陰性金葡和24株PVL陽性金葡中，PVL陽性株能在4448m/z質譜峰處檢測到特異質譜峰。應用此特異質譜峰篩選34株金葡，發現2株PVL陽性株。此種方法的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為100%、90.6、40和100%。

　　4、深度應用

　　4.1 MALDI-TOF MS對血培養的直接鑒定

　　菌血癥、敗血癥及膿毒血癥等血流感染的感染率逐年增高，發病急、致死率高使其對快速微生物鑒定的需求更加緊迫。

　　Katherine Bond等研究報道了應用MALDI-TOF MS直接對血陽性瓶進行鑒定的應用。與傳統培養需要24h或更多時間的檢測技術相比，MALDI-TOF MS可以在4~6小時內對血液標本中的致病菌進行檢測和鑒定。荷蘭的Marc Bonten團隊研究顯示對血液標本中的致病菌進行MALDI-TOF MS鑒定的平均時間是16小時，與傳統的檢測方法需要45小時相比大大縮短了檢測時間，也為臨床合理應用抗生素治療提供了可靠的依據。美國休斯敦的James Musser團隊的研究數據顯示應用MALDI-TOF MS后，膿毒血癥患者的住院時間平均縮短了3天。

　　Foster AG等從需氧、厭氧和兒童瓶三種血培養瓶中選出253份陽性標本利用MALDITOF MS進行檢測，分別有92.1%和88.1%被鑒定到屬和種；其中161株革蘭陽性菌分別有95.7%和90.1%被鑒定到屬和種；92株革蘭陰性菌分別有84.7%和83.7%被鑒定到屬和種。

　　Jamal W等對160例血培養陽性標本進行傳統方法檢測和MALDI-TOF MS直接鑒定。Bruker SepsiTyper kitTM（STK）和傳統方法的檢出率分別為114（75.6%）和150（93%），利用STK鑒定中，36例鑒定不準確或未鑒定出，其中5例分值>2.000，31例分值不可信<1.7。8株真菌中準確鑒定4株。包括提取步驟，使用STK的平均時間是35分鐘。

　　有研究報道顯示，利用MALDI-TOF MS技術直接鑒定血培養瓶中的真菌， 95.9%（187/195）的白色念珠菌與傳統培養鑒定方法一致，86.5%（128/148）的非白色念珠菌與傳統培養鑒定方法一致，且平均時間在30分鐘左右。

　　4.2 MALDI-TOF MS對尿液的直接鑒定

　　傳統尿液微生物的檢測依賴于涂片及細菌的培養，但臨床更傾向于快速的檢測技術，現在常規使用的技術并不能滿足臨床的需要。MALDI-TOF MS技術的優勢可以彌補傳統方法的不足。

　　Ferreira L等對尿路感染的尿液標本分別進行傳統檢測和MALDI-TOF MS鑒定。260例尿液標本被UF-1000i、細菌培養和MALDI-TOF MS都鑒定為陽性；20例標本被UF-1000i鑒定為陽性，而培養和MALDI-TOFMS都鑒定為陰性。220份標本細菌生長>105CFU/ml，其中202例（91.8%）鑒定到種，204例（92.7%）鑒定到屬，鑒定率最高的是大腸桿菌173株。173株大腸桿菌中MALDI-TOF MS鑒定出163株（94.2%）。

　　有學者對收集到的1040份尿液標本進行了尿細菌培養及直接質譜鑒定，其結果顯示1040份標本中共鑒定出細菌的標本有52 6份，其中包括培養出1種菌的標本430份，尿病原菌直接質譜鑒定率為92.7%（430/464）；培養出2種菌的標本96份，尿病原菌直接質譜鑒定率為75%（96/128）；尿病原菌直接質譜鑒定法鑒定出的細菌與尿細菌培養法鑒定出的細菌菌種一致，符合率為100/100。王新華等結合UF-1000i 和MALDI-TOF MS直接對1456例尿路感染的尿液標本進行鑒定，鑒定的準確率為1381（94.8%）。

　　4.3 質譜與核酸研究

　　現代質譜技術自誕生以來，在多肽及蛋白質的研究中獲得極大的成功，于是人們開始嘗試著將質譜技術用于核酸的研究工作。近年來，合成寡核苷酸及其類似物，作為反義治療劑在病毒感染和一些癌癥的治療方面，有著良好的前景。

　　寡核苷酸作為藥物，其結構特征必須進行確證。常規的色譜或電泳技術只能對其濃度和純度進行分析，而對其堿基組成、序列等結構信息卻無能為力。ESI和MALDI質譜技術出現，為寡核苷酸及其類似物的結構及序列分析，提供了強有力的方法。它是將被測寡核苷酸樣品先用外切酶從3’或5’ 端進行部分降解，在不同時間內分別取樣進行質譜分析，獲得寡核苷酸部分降解的分子離子峰信號，通過對相鄰兩個碎片分子質量進行比較，可以計算出被切割的核苷酸單體分子質量，將其與四個脫氧核苷酸的標準分子量進行對照，就可以讀出寡核苷酸的序列。

　　由于MALDI-TOF MS技術分辨率的問題，使得其更適合于堿基數較少的短鏈核酸的分析。如何獲得高分辨率的DNA質譜圖，一時間成為了研究的熱點問題，由于DNA的化學結構存在著不同于蛋白質的結構特征，使得DNA樣品存在某些特殊性：1、其結構中存在著磷酸基團，有形成鈉磷化合離子的趨勢。2、在激光解吸離子化過程中，它的結構不如蛋白質穩定，易形成碎片，這導致峰寬和分子離子的強度變弱，從而使得分辨率下降。1995年，M. L. Vestal 等把離子延遲引出技術應用于MALDI-TOF MS中來，不但提高了MALDI-TOF MS的分辨率，而且也開創了質譜應用于DNA研究領域的新局面。國內鄧慧敏等也應用MALDI-TOF MS法測定了混合堿基DNA，獲得了高分辨率的DNA質譜圖。

　　5、細菌或真菌的耐藥性檢測和耐藥機制研究

　　5.1 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測

　　MALDI-TOF MS常用于鑒別MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）。由染色體DNA介導的固有耐藥性，主要是mec基因編碼的PBP2a的耐藥性，這是最常見的耐藥機制。MALDI-TOF MS主要通過檢測MRSA蛋白表達的差異，來實現耐藥性的檢測。Edwards-Jones V等研究發現MRSA與MSSA的MALDI-TOF MS檢測質譜圖存在明顯差異，如MRSA特異性峰m/z位于891，1140，1165，1229和2127 Da，而MSSA特異性峰m/z位于2548 和2647 Da。Du Z等對76株金黃色葡萄球菌進行MALDI-TOF MS耐藥性檢測，結果顯示MSSA與MRSA的質譜圖的差異集中在2400 Da至2500 Da區間。Majcherczyk等研究也提出MALDI-TOF MS可以用于金黃色葡萄球菌的甲氧西林耐藥檢測。2012年，Lu等研究了MALDI-TOF MS鑒別社區獲得性MRSA與醫院獲得性MRSA的方法，而且證實了兩種細菌之間的差異質譜峰（m/z 1774 Da和 1792 Da）是社區獲得性MRSA特異性表達的酚可溶性調控蛋白。本實驗室的研究證明MALDI-TOF MS通過質譜峰值的比對可區分MRSA與MSSA。

　　5.2 萬古霉素耐藥的腸球菌（VRE）的檢測

　　MALDI-TOF MS用于VRE檢測的研究并不多，Griffin通過對質譜峰數學建模的方式，能夠將攜帶vanB基因的VRE與萬古霉素敏感的屎腸球菌鑒別。

　　5.3 革蘭陰性桿菌耐藥性檢測

　　外膜蛋白OmpK36的缺失與AmpC酶聯合可以導致細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥。國內研究還將MALDI-TOF MS應用于克雷伯菌屬的細胞外膜蛋白OmpK36的檢測，在檢測外膜蛋白方面MS明顯優于傳統的SDS-PAGE方法。

　　產ESBLs酶或碳青霉烯酶是革蘭氏陰性桿菌耐藥的最主要原因。MALDI-TOF MS檢測的原理是β-內酰胺類抗生素的β內酰鍵被細菌產生的β-內酰胺類酶水解，導致抗生素分子量增加18Da。抗生素的羥基會與鹽溶液中的Na結合導致分子量增加22Da。某些環境下，水解產物會直接脫羧，引起分子量減少44Da。通過質譜監測β-內酰胺類抗生素分子量的變化，即可準確鑒定細菌產β-內酰胺類酶。近兩年，國內外研究集中在MALDI-TOF MS腸桿菌的KPC、VIM、IMP、NDM及OXA[30-31]菌株鑒定上。不同研究組所選擇的β-內酰胺類抗生素、基質、緩沖液、水解時間、質譜儀參數、質譜圖分析等均有所差異，導致質譜圖的判斷標準不一致，需要進一步優化方法，建立標準化的檢測程序，使研究結果具有可比性。國內研究將ClinPro Tools軟件與質譜的檢測相結合，通過數學建模實現質譜圖的自動化分析，實現耐藥細菌與敏感細菌的自動分組鑒別。

　　5.4 耐藥基因突變的檢測

　　MALDI-TOF MS的微測序法可以檢測耐藥基因的單核苷酸多態性。Ikryannikova等應用MALDI-TOF MS微測序法檢測了利福平耐藥結核分枝桿菌的rpoB基因及異煙肼耐藥結核分枝桿菌katG基因的突變，同時該研究組還應用此技術檢測了blaTEM基因突變。

　　5.5 真菌藥物敏感試驗的檢測

　　檢測原理是真菌在不同濃度的抗真菌藥的壓力下，表達的蛋白組會不同，MALDI-TOF MS可以檢測其蛋白譜的變化。Carolis 應用MALDI-TOF MS檢測了酵母菌及曲霉菌的卡泊芬凈的最低抑菌濃度。

　　6、質譜目前仍存在的缺陷

　　MALDI-TOF MS技術利用自己獨特的優勢，在多個領域都起到了至關重要的作用，然而，由于技術的不夠完善及臨床要求的不斷提高，MALDI-TOF MS的缺陷也一一顯現出來。

　　作為一項新技術，MALDI-TOF MS雖在多個領域都顯示出它的優勢，然而最初的儀器成本高是我們不得不接受的事實，這就使一些臨床機構望而卻步。

　　由于MALDI-TOF MS技術的原理是基于不同的蛋白質譜圖，所以需要純培養或單個菌落，這就為難培養病原體提出了新的挑戰，也增加了標本的前處理難度。而且MALDI-TOF MS也不能將蛋白表達相近的細菌區分，為臨床對不同菌種的鑒定提出了挑戰。

　　臨床的需求不斷增加，現有的數據庫并不能滿足臨床的需求，對一些不常見病原體，MALDI-TOF MS缺乏相應的數據庫，因此我們需要去豐富現有數據庫，增加一些罕見菌的質譜圖來滿足臨床的需要。

　　基于MALDI-TOF MS技術的原理，我們只能對病原體做到定性，很難做到定量。雖然在抗生素耐藥方面我們已經取得了一定的成效，但是對抗生素耐藥性的檢測能力有限。而且作為一項新技術對于報告結果的驗證和解釋缺乏統一的實用性的操作手冊，因此仍我們要求在以后的科研和工作中不斷去鉆研去完善。