MAPK激酶活性檢測

實驗概要

本實驗提供了一個MAPK激酶活性的檢測方法。

主要試劑

1uM f1g22，10uM flg22
0.02% Silwet L-77
液氮

蛋白提取緩沖液(100 mM Hepes, pH 7.5,5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10mM DTT, 10 mM Na₃VO₄,  10 mM NaF, 50 mM P-glycerophosphate, 1 mMphenylmethylsulfonyl fluoride,  5 pg/mL antipain, 5 pg/mL aprotinin, 5 pg/mL leupeptin,10% glycerol,  7.5% polyvinylpolypyrrolidone)

0.25 mg/mL myelin basic protein(MBP)

漂洗緩沖液(25mM Tris, pH 7.5, 0.5mM DTT,0.1mM Na₃V0₄, 5mM NaF, 0.5 mg/mL BSA, 0.1%Triton X-100)

復性緩沖液(25mM Tris, pH 7.5, 1mM DTT, 0.1mM Na₃VO₄, 5 mM NaF)

200nM的ATP，50uCi r-P³²-ATP

主要設備

高速離心機，研缽，蛋白電泳槽，電泳儀，Phosphorlmager

實驗材料

植物葉片

實驗步驟

1.  挑選約5-6周大且生長狀態良好的植物葉片，按照原生質體分離方法(http: //www. genetics. mgh. harvard.  edu_ sheenweb)分離原生質體。分別轉化各實驗中對應的質粒后室溫孵育6小時，再加入1uM  f1g22或者水處理10分鐘后提取蛋白，進行in-gel kinase assay。在植物中，將10uM flg22或者水，再加上0.02%  Silwet L-77后均勻的噴灑在植物葉片上，10分鐘后取下葉片提蛋白，進行in-gel kinase assay。

2. 蛋白提取

   1) 取6-8片葉片，液氮速凍后研磨成粉末。

   2) 加入蛋白提取緩沖液繼續研磨直至均勻。

   3) 14000rpm于4℃離心10分鐘，取上清。

3. 激酶活性分析

   1) 在分離膠中摻入0.25 mg/mL myelin basic protein(MBP)作為激酶底物，配制成10%的SDS-PAGE膠，取10ug蛋白電泳。

   2) 電泳結束后取下蛋白膠，用漂洗緩沖液于室溫洗三次，每次30分鐘。

   3)將蛋白膠置于復性緩沖液中于4℃過夜，中間換3次緩沖液。

   4) 將復性后的蛋白膠置于反應緩沖液中，再加入終濃度為200nM的ATP以及50uCi r-P³²-ATP，反應60分鐘。

   5) 用終止緩沖液漂洗蛋白膠6次，每次60分鐘。

   6) 取出蛋白膠干膠后儲存于Phosphorlmager。

   7) 24小時后放射自顯影。